《Journal of Chromatography A》：Green Supramolecular Solvent for the Liquid Phase Microextraction of beta-blockers from Biological Samples: A Cationic Surfactant-Monoterpene system
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本研究开发了一种新型绿色超分子溶剂（SUPRAS）液相微萃取方法，用于从生物样本中提取两种β-阻断剂（卡维地洛，CARV；普萘洛尔，PROP）。该超分子溶剂通过将阳离子表面活性剂戊胺与单萜化合物萜品醇在含水样品中原位自组装形成混合超分子聚集体。研究人员以萜品醇
本研究开发了一种新型绿色超分子溶剂（SUPRAS）液相微萃取方法，用于从生物样本中提取两种β-阻断剂（卡维地洛，CARV；普萘洛尔，PROP）。该超分子溶剂通过将阳离子表面活性剂戊胺与单萜化合物萜品醇在含水样品中原位自组装形成混合超分子聚集体。研究人员以萜品醇作为凝聚剂，其低熔点特性显著简化了分析流程，避免了固体凝聚剂所需的称量、熔融或长时间溶解步骤。经优化后，该方法对普萘洛尔和卡维地洛的萃取回收率（ER）分别达到约88%和近定量水平（>80%）。结合高效液相色谱-荧光检测（HPLC-FLD），方法检出限（LOD）分别为0.1 ng/mL（普萘洛尔）和0.2 ng/mL（卡维地洛），定量限（LOQ）分别为0.3和0.7 ng/mL。方法在5–100 ng/mL范围内呈现良好线性（决定系数R2均大于0.9909），日内和日间精密度以变异系数（CV）表示分别低于12.2%和13.7%，准确度以相对回收率（%RR）表示在83.4%至116.1%之间，符合生物分析方法验证的接受标准。该方法已成功应用于健康志愿者人尿液和血清样本中目标分析物的测定，相对回收率为87.4%至113.8%。通过FT-IR和1H/13C-NMR光谱表征证实，超分子溶剂的形成基于非共价相互作用（包括氢键、疏水缔合和离子相互作用），而非共价键的生成。绿色评价方面，该方法的绿色评估指标（GEMAM）得分为69.5，蓝色分析绿色度指数（BAGI）为70.0，紫色创新等级指数（VIGI）为70.0，红色分析性能指数（RAPI）为52.5，综合白度得分为65.5%，表明该方法在环境可持续性、操作实用性和分析性能之间取得了良好平衡。与已报道的方法相比，该方法首次将基于阳离子表面活性剂-单萜体系的超分子溶剂微萃取应用于β-阻断剂的生物样本分析，在灵敏度上优于多数基于高效液相色谱-紫外（HPLC-UV）或毛细管电泳-紫外（CE-UV）检测的方法，并具有操作简便、试剂消耗少且无需盐析等优势。
一、研究背景与目标
液相微萃取（LPME）是一种高效、低溶剂消耗的样品前处理技术，其核心挑战在于针对不同基质和分析物选择合适的萃取溶剂。传统有机溶剂存在毒性高、挥发性强等缺点，因此环境友好型溶剂逐渐成为研究热点，包括低共熔溶剂（DES）、可切换亲水性溶剂、生物基溶剂和超分子溶剂（SUPRAS）等。SUPRAS是由两亲分子通过氢键、π–π堆积、范德华力、静电相互作用和疏水效应等非共价相互作用自发自组装形成的纳米结构液体，具有高度异质的微环境，可同时与多种极性和非极性分析物建立多重相互作用，因而在液相微萃取中展现出优异的选择性和富集能力。此前已有研究将伯胺与天然单萜类化合物组合用于SUPRAS形成，但将液态单萜（萜品醇）与阳离子表面活性剂联用并应用于生物样本中β-阻断剂萃取尚属首次。β-阻断剂（如普萘洛尔和卡维地洛）在治疗心血管疾病中应用广泛，其生物样本中的浓度监测对药物动力学研究和治疗药物监测具有重要意义。然而，生物基质复杂、分析物浓度低，需采用有效的样品前处理技术进行净化和富集。本研究旨在开发一种基于戊胺-萜品醇体系的绿色SUPRAS液相微萃取方法，结合高效液相色谱-荧光检测，实现人尿液和血清中卡维地洛和普萘洛尔的灵敏、可靠测定。
二、研究内容与主要结论
研究人员以阳离子表面活性剂戊胺为两亲组分、单萜化合物萜品醇为凝聚剂，在经三氟乙酸（TFA）沉淀蛋白后的生物样本上清液中原位形成超分子溶剂。通过筛选不同胺类化合物（包括N,N-二甲基环己胺、三丁胺、己胺、庚胺、辛胺、苄胺和戊胺）以及不同萜类化合物（萜品醇、丁子香酚、柠檬烯、冰片、香叶醇和橙花醇），最终确定戊胺与萜品醇为最佳组合。该组合能形成清晰可分离的SUPRAS相，萃取回收率高，且与后续色谱分析兼容。经傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和核磁共振波谱（1H/13C-NMR）表征，证实SUPRAS的形成机制涉及酸-碱相互作用、疏水缔合、离子对形成和氢键作用，体系中各组分保持原有分子结构，未生成新的共价化合物。在优化实验中，研究人员考察了戊胺体积（100–300 μL）、萜品醇体积（50–300 μL）、样品pH（3.0–7.0）和样品体积（500–1500 μL）对萃取回收率的影响。结果表明，200 μL戊胺和200 μL萜品醇为最佳用量，此时SUPRAS相体积为330 ± 26 μL，相比（Vaq/VSUPRAS）为5.3；样品pH在3.0–7.0范围内对萃取效率无显著影响，表明TFA沉淀蛋白后残留的酸不会干扰SUPRAS原位形成；盐的添加对萃取回收率无改善作用，因此被省略。方法验证严格遵循ICH Q2(R2)指南，考察了选择性、线性、基质效应（ME）、灵敏度、准确度和精密度。在5–100 ng/mL范围内，两种分析物在水和生物基质中的校准曲线均呈良好线性（R2 > 0.9909）。基质效应评估显示，普萘洛尔在尿液和血清中的基质效应分别为1%和2.5%，无显著基质干扰；卡维地洛则表现出中等基质效应（血清中为?18%，尿液中为+56%），因此采用基质匹配校准曲线进行定量。灵敏度方面，普萘洛尔和卡维地洛的检出限分别为0.1和0.2 ng/mL，定量限分别为0.3和0.7 ng/mL，最低定量下限（LLOQ）均为5 ng/mL。准确度和精密度通过四个质量控制浓度水平（LLOQ、低QC、中QC、高QC）评估，日内和日间变异系数分别低于12.2%和13.7%，准确度在83.4%至116.1%之间，符合生物分析方法验证的接受标准（±15%，LLOQ处±20%）。
三、关键技术与方法
研究人员采用了以下主要技术方法：（1）基于戊胺-萜品醇体系的SUPRAS原位形成：在含分析物的水相中加入200 μL戊胺，涡旋形成各向同性溶液后加入100–200 μL萜品醇，涡旋混合后经离心（10,000 rpm，2 min）使SUPRAS微滴聚结并分层，收集上层SUPRAS相；（2）高效液相色谱-荧光检测（HPLC-FLD）：采用Discovery C18 HS色谱柱（250 × 4.6 mm，5 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A相）和甲醇（B相），梯度洗脱，流速1 mL/min，进样量10 μL，荧光检测激发/发射波长为290/340 nm；（3）傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和核磁共振波谱（1H/13C-NMR）用于SUPRAS形成机制表征；（4）方法验证依据ICH Q2(R2)指南进行，包括选择性、线性、基质效应、灵敏度、准确度和精密度评估。生物样本（人尿液和血清）来自健康志愿者，样本在?18°C下储存不超过三个月，分析前采用TFA沉淀蛋白预处理。
四、研究结果与分析
3.1 初步实验与组分筛选：研究人员通过系统筛选确定了戊胺与萜品醇的最佳组合。长链胺（如己胺、庚胺、辛胺等）因疏水效应在水相中形成独立层，不符合原位SUPRAS形成的要求；辛胺对普萘洛尔的萃取回收率低于15%；冰片为固体，难以重复分装且相分离效果不佳；香叶醇干扰色谱分离；柠檬烯在甲醇稀释后产生浑浊。相比之下，萜品醇和橙花醇能形成清晰可回收的SUPRAS相。尽管苄胺的萃取回收率略高（73.2–79.3%），但其在检测波长处有强吸收，产生干扰峰，最终选择萃取回收率为66.1–73.3%的戊胺。单独使用萜品醇而不加表面活性剂时，萃取回收率低于30%，表明阳离子表面活性剂对有效萃取至关重要。
3.2 SUPRAS相形成机制与表征：FT-IR光谱显示，SUPRAS形成后O–H伸缩振动带从3385 cm?1移至3379 cm?1且峰形改变，表明极性基团氢键环境发生变化；C–H伸缩振动带（2970和2926 cm?1）保留，说明疏水烷基和萜烯部分存在于分离相中；指纹区约1148 cm?1处出现新特征峰，但未检测到新共价官能团。1H和13C-NMR谱进一步证实各组分的特征共振峰均保留，仅发生微小化学位移变化，如萜品醇的4.61→4.57 ppm和5.30→5.27 ppm，戊胺的2.38→2.36 ppm；13C-NMR中戊胺信号从33.70和42.03 ppm移至33.03和41.62 ppm，萜品醇含氧碳区信号系统地向高场移动（如68.25→67.66 ppm）。这些变化表明超分子相中氨基和羟基区域的局部电子环境发生改变，支持通过氢键、疏水缔合和离子相互作用形成非共价自组装。
3.3 SUPRA微萃取条件优化：戊胺体积从100 μL增至200 μL时，普萘洛尔回收率从约59%提升至88%，卡维地洛从73%提升至近定量萃取；继续增至300 μL无显著改善。萜品醇体积在50 μL时回收率较低且不稳定（45%和48%），增至200 μL时普萘洛尔和卡维地洛回收率分别达73%和88%。样品pH 3.0–7.0范围内对萃取无显著影响。样品体积增至1500 μL时卡维地洛回收率提高，但考虑到富集倍数，选择1000 μL为最佳。SUPRAS相与甲醇以1：4比例稀释（5倍稀释）可获得澄清溶液和良好色谱峰形。
3.4 方法验证：选择性实验中，空白人尿液和血清样本（n=6）在目标分析物和ISTD保留时间处无干扰峰。校准曲线在5–100 ng/mL范围内线性良好，R2均大于0.9909。普萘洛尔在尿液和血清中的基质效应分别为1%和2.5%，卡维地洛分别为-18%（血清）和+56%（尿液），因此卡维地洛采用基质匹配校准。日内和日间精密度（CV）在尿液样本中低于8.9%和11.1%，在血清样本中低于12.2%和13.7%；准确度（%RR）在尿液中为87.8%至116.1%，在血清中为83.4%至114.7%。
3.7 实际样本应用：通过对2名健康志愿者的人尿液和血清样本进行加标回收实验（5、10、30、50和100 ng/mL五个水平），相对回收率为87.4%至113.8%，CV均低于11.7%，证明方法在实际生物样本分析中的可靠性。
3.8 白度评估与环境比较评价：采用四维评价工具（MA-多色）评估方法的综合性能。GEMAM得分为69.5分，反映其微观尺度萃取、低萃取材料消耗、无盐添加和短样品处理流程的环境友好特征；BAGI得分为70.0分，表明方法具有满意的实际可操作性和简便性；VIGI得分为70.0分，体现了该方法在样品制备方面的创新性；RAPI得分为52.5分，提示线性范围较窄和卡维地洛基质效应仍有改进空间。综合白度得分为65.5%，将方法归类为“良好”等级。
3.9 与已报道方法的比较：与文献报道的多种方法相比，本方法对卡维地洛（0.2 ng/mL）和普萘洛尔（0.1 ng/mL）的检出限低于多数HPLC-UV和CE-UV方法，例如DLLME法（5和6 ng/mL）和亚零度生物溶剂LLME法（11 ng/mL）。该方法的灵敏度可与部分LC-MS/MS方法相媲美，且无需特殊的固相萃取装置、镀层纤维、膜或复杂设备。精密度（CV <13.7%）和相对回收率（83.4–116.1%）与文献相当，表明其在生物基质中具有令人满意的分析性能。
五、讨论与结论
讨论部分指出，该方法通过采用液态单萜（萜品醇）替代固体凝聚剂，显著简化了超分子溶剂的制备流程，避免了称量、熔融和长时间溶解等步骤。SUPRAS的纳米结构提供了多重相互作用位点，有利于目标分析物的高效分配和富集。尽管方法在灵敏度、精密度和准确度方面表现良好，线性范围（5–100 ng/mL）相对较窄，卡维地洛在生物基质中的基质效应需要通过基质匹配校准来校正。绿色评价结果表明方法在环境友好性、操作实用性和创新性方面具有优势，但甲醇的使用是影响绿色度的主要因素，未来可探索更环保的稀释溶剂和流动相替代方案。
结论部分可翻译为：本研究开发了一种新型的基于超分子溶剂的液相微萃取方法，用于生物样本中两种β-阻断剂（卡维地洛和普萘洛尔）的萃取和测定。超分子溶剂通过戊胺（阳离子表面活性剂）与萜品醇（单萜凝聚剂）的组合原位形成，为两种药物提供了有效的萃取介质。液态萜品醇的低熔点特性简化了超分子溶剂的形成过程，消除了固体凝聚剂相关的称量、熔融和长时间溶解等额外步骤。在对主要萃取变量进行优化后，该方法实现了高效的分析物萃取和富集，同时最大程度地减少了基质相关的干扰。方法在线性、检出限、精密度和准确度方面均表现出令人满意的分析性能。这些特性使其成功应用于尿液和血清样本中目标β-阻断剂的测定。总体而言，该超分子溶剂拓展了这类纳米结构溶剂在生物分析样品制备中的应用潜力。萃取材料消耗低、实验流程简便和分析性能良好，突显了该方法作为生物样本中β-阻断剂常规分析替代样品制备策略的潜力。方法的部分方面仍可进一步改进，例如用危害更低的试剂替代三氟乙酸以及引入自动化操作，以提高其绿色度和实用性。
