《Journal of Invertebrate Pathology》：Highly sensitive detection and identification of six viruses in shrimps by universal primer based multiplex PCR
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•开发了一种基于通用引物的多重 PCR 方法，可同时检测六种虾病毒。•该检测方法的灵敏度达到 5–50 拷贝/μL，比常规方法高 10–100 倍。•两阶段扩增策略有效抑制了非特异性扩增和引物二聚体。•该检测方法为虾病毒疾病的早期防控提供了一种高效的技术途径。引言虾是全球重要
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开发了一种基于通用引物的多重 PCR 方法，可同时检测六种虾病毒。
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该检测方法的灵敏度达到 5–50 拷贝/μL，比常规方法高 10–100 倍。
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两阶段扩增策略有效抑制了非特异性扩增和引物二聚体。
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该检测方法为虾病毒疾病的早期防控提供了一种高效的技术途径。
引言
虾是全球重要的海洋养殖物种，具有巨大的经济价值，约占全球甲壳类动物养殖总产量的 61%，是许多发展中国家经济发展的基石（Prochaska et al., 2022）。然而，虾养殖业的快速增长伴随着传染病爆发的不断加剧，这威胁着养殖和野生虾群，破坏了行业的可持续性，并造成了巨大的经济损失（Arulmoorthy et al., 2020; Thitamadee et al., 2016）。其中，病毒性疾病尤为严重，由于其高传染性和死亡率，约占行业损失的 60%，超过细菌和真菌感染（Lightner et al., 2012; Stentiford et al., 2012）。能感染对虾的主要致病病毒包括 TSV、IHHNV、WSSV、MBV、HPV 和 YHV（Khawsak et al., 2007）。在本研究的目标病毒中，WSSV 是对虾研究最为透彻的病毒病原，可引起皮肤变红或变粉以及外骨骼出现白斑等症状（Jeeva et al., 2014）。它极具致病性，感染后 7-10 天内，各生命阶段的虾死亡率高达 100%（Verbruggen et al., 2016; Zhu et al., 2019）。IHHNV 感染虾主要表现为生长迟缓，偶尔出现矮小症、畸形以及易感性显著增加（Nita et al., 2012; Vega-Heredia et al., 2012）。TSV 感染外胚层和中胚层组织，特别嗜好造血组织、皮下结缔组织、表皮上皮、淋巴器官和触角腺（Xie et al., 2007）。TSV 感染虾的特征是不规则的黑色斑疹、肌肉不透明、外骨骼变软、游泳不规则、身体松软和体色发红，死亡率在 60% 到 90% 之间（Dhar et al., 2004; Poulos et al., 2006; Tang et al., 2004）。YHV 主要感染虾的幼体阶段，感染宿主主要表现为低色素血症和全身性发白（Kiatpathomchai et al., 2004）。MBV 常与 WSSV 和 HPV 混合感染，导致虾肝胰腺坏死、萎缩和肝功能受损（Tang and Lightner, 2011）。虾病毒性疾病的传播途径复杂且多方面，包括活体水生动物运输和贸易、环境波动、活饵循环、同类相食行为、应激反应以及养殖种群内的遗传同质性等因素，这些都使得有效控制疫情变得困难（Vijayan et al., 2005）。此外，甲壳类动物通常携带多种病毒病原，且在感染早期无明显临床症状或病理特征，特别是在病毒载量较低时。鉴于目前缺乏治疗虾病毒疾病的有效干预措施，开发快速灵敏的检测技术不仅对于早期诊断至关重要，也能通过迅速切断传播途径确保养殖业的可持续发展（Tong et al., 2022）。
目前，我们有多种方法可用于检测虾病毒。传统的早期诊断方法，如病毒分离、血清学分析和抗原检测，由于处理时间相对较长且灵敏度较低，经常遇到应用限制。相比之下，先进的分子检测技术的出现推动了 LAMP、常规 PCR、qPCR 和多重 PCR 等技术在病毒诊断中的突出地位（Liu et al., 2013; Yadav et al., 2015）。这些方法已获得世界动物卫生组织（WOAH）的认可，作为可靠的病原体鉴定工具。在这些方法中，多重 PCR 已成为同时检测虾病毒的一项特别有价值的工具。它能够在单次反应中同时鉴定多种病原体，具有有效性、成本效益和简便性等特点，使其非常适合虾养殖业的高通量筛选。然而，其广泛应用仍受到一些固有限制的制约（Zhang et al., 2023）。
在目前报道的虾病毒多重 PCR 检测中，绝大多数只能同时检测 2-4 种病毒，这不足以虾养殖业对多种高致病性病毒进行“一站式”筛查的实际需求（Jeeva et al., 2014; Xie et al., 2007）。尽管研究了开发一种可检测 6 种虾病毒的多重 PCR-ELISA 系统，但测试灵敏度仍然很低，且程序繁琐，不适合检测感染早期病毒载量极低时采集的样本（Khawsak et al., 2007）。为解决这些问题，我们的研究团队最近开发了一种多重 PCR 测试，用于检测和区分六种虾病毒，这显著提高了灵敏度和便利性，从而为虾病毒的早期诊断提供了更高效的技术选择（Wang et al., 2025）。然而，在分析低病毒载量的临床样本时，更高的灵敏度通常更有利（Pantoja and Lightner, 2003）。此外，随着检测靶标数量的增加，多重 PCR 面临扩增效率降低、不同模板间扩增不一致以及通用性有限等挑战（Hanapi et al., 2015; Xu et al., 2012）。总之，这些局限性突显了开发更先进、更稳健的多重 PCR 方法的紧迫需求。
在本研究中，我们建立了一种通用引物介导的多重 PCR（UP-M-PCR）方法，利用本组鉴定出的高效通用引物 UP2（Nan et al., 2021），可同时检测六种虾病毒，并评估了其分析特异性和灵敏度。随后将该检测方法应用于现场虾样本测试，并通过将其结果与通用引物介导的单重 PCR（UP-S-PCR）及单重实时 PCR 检测结果进行比较，评估了其诊断性能。
章节摘要
样本采集与核酸提取
虾样本采集于 2020 年 11 月至 2021 年 11 月期间的浙江省杭州市新农都水产品市场。将 5 只虾的不同组织混合成一个样本，共获得 236 个混合样本。参照所述方法（Liu, 2023），使用 0.2 克冷冻虾组织（鳃、肝胰腺和肌肉）作为起始材料，对 236 个混合样本进行核酸提取和逆转录。得到的 cDNA/DNA
特异性检测
为验证 UP-S-PCR 方法的分析特异性，将单个目标病毒 cDNA/DNA、五种非目标病毒 cDNA/DNA 和虾基因组 DNA 分别加入各反应中。电泳分析（图 1）表明，单重 PCR 中的所有反应均特异性扩增了目标病毒预期的基因片段：WSSV（537 bp）、IHHNV（469 bp）、HPV（395 bp）、MBV（311 bp）、TSV（593 bp）和 YHV（237 bp）。阴性对照中未检测到扩增
讨论
虾养殖业因单一或多种病毒病原感染造成重大年度经济损失，这对全球行业的可持续性构成重大威胁。鉴于目前缺乏治疗虾病毒疾病的有效干预措施，开发快速精准的诊断工具对于减轻病毒传播和减少经济影响至关重要。虽然常规多重 PCR 在
CRediT 作者贡献声明
杨金宇：撰写 – 初稿，正式分析，数据整理。王佩：撰写 – 初稿。张秋雅：调查，数据整理。刘勤：调查。姜永侯：撰写 – 审阅与编辑，监督，项目管理，方法论，资金获取，概念化。
利益冲突声明
作者声明不存在已知可能影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到浙江省自然科学基金（LGC21C180002）的支持。
杨金宇 | 王佩 | 张秋雅 | 刘勤 | 姜永侯
