一种快速便携平台整合蜱虫样本处理、核酸提取和qPCR，用于四种蜱传病原体的灵敏检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：A Rapid and Portable Platform Integrating Tick Samples Process, Nucleic Acid Extraction and qPCR for Sensitive Detection of Four Tick-borne Pathogens

便携式微流控平台实现了四种蜱传播病原体的现场检测。手持式一次性研磨器便于在野外条件下无需设备进行蜱虫裂解和过滤。微型化卡盒集成了核酸提取和四重实时定量PCR扩增。整个工作流程在42分钟内完成，检测限达到每毫升1122至2413个拷贝。使用野外采集的蜱虫和临床样本进行验证，为现场新发传染病监测提供了可靠工具。引言蜱虫是全球第二大病原体传播媒介，仅次于蚊子，是多种病毒、细菌和螺旋体的储存宿主[1], [2]。通过跨期和经卵传播途径，它们在自然界中形成了复杂多样的移动病原体储库[3]。在气候变化和人类活动扩张的驱动下，蜱传播疾病的全球流行态势加剧，构成了严重的公共卫生威胁[4], [5]。值得注意的是，对流行区（如中国）的全面空间测绘显示，主要蜱虫媒介的生态位正在扩大，高风险病原体广泛分布，凸显了对分散式监测工具的迫切需求[6]。在众多蜱传播病原体中，选择了蜱传脑炎病毒（TBEV）、发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV，近期更名为大别班达病毒）、克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）和嗜吞噬细胞无形体（AP）作为主要检测目标。TBEV、SFTSV和CCHFV因高致病性、严重临床后果及不断扩大的流行范围，被列为世界卫生组织优先关注的高病死率重大病毒威胁[7], [8], [9]。TBEV感染可导致20-40%的病死率及严重的永久性神经后遗症[7], [8]；SFTSV和CCHFV感染常引发多器官功能衰竭和弥散性血管内凝血等危及生命的并发症，病死率分别高达30%和10-50%[10], [11]。这些病原体的早期临床症状包括高热、乏力和肌痛，高度相似。基于其流行病学流行程度和临床相关性，AP被选为代表性的细菌目标。近期高分辨率国家测绘表明，AP是中国分布最广的蜱传播病原体之一，常与上述病毒在全沟硬蜱和长角血蜱等共同媒介中协同循环[6]。临床上，由AP引起的人类粒细胞无形体病（HGA）表现为非特异性发热症状、白细胞减少和血小板减少，与严重病毒感染的早期阶段极为相似，使其成为关键的鉴别诊断[12], [13]。此外，高共感染风险使疾病管理复杂化并加重患者预后。因此，建立针对该特定面板的快速鉴别诊断能力，对于指导适当的抗菌治疗和遏制疫情传播至关重要。目前，实时定量PCR（qPCR）因其高灵敏度和特异性被认为是病原体鉴定的金标准[14], [15], [16]。FilmArray和AIGS等多种集成平台推动了基于qPCR的病原体即时检测（POCT）发展，并显示出良好的临床可用性；然而，现有的POCT系统通常针对均质标本（如咽拭子、唾液）进行优化，缺乏直接处理蜱虫等复杂组织的能力[17], [18], [19]。此外，目前没有专门的集成工具可同时快速检测TBEV、CCHFV、SFTSV和AP。这些局限性严重阻碍了流行区及时进行病原体监测、溯源和早期诊断。为解决这些关键的诊断差距，本研究旨在开发一种集成系统，用于现场检测四种蜱传播病原体：TBEV、CCHFV、SFTSV和AP。该平台将三个核心步骤——现场样本均质化、基于磁珠的核酸提取和多重实时qPCR——整合为一个工作流程，实现现场条件下的"样本到结果"检测。通过克服复杂样本处理的瓶颈，该系统为高威胁蜱传播疾病的快速鉴别诊断和疫情监测提供了实用解决方案。章节片段质粒、病毒和假病毒重组质粒和RNA：将TBEV、SFTSV、CCHFV和AP的目标基因序列分别插入质粒pSE380-MS2或pUC57的多克隆位点中，构建含有各病原体目标基因的重组质粒，命名为pSE380-MS2-TBEV、pSE380-MS2-SFTSV、pSE380-MS2-CCHFV和pUC57-AP。使用T7 RNA聚合酶将质粒pSE380-MS2-TBEV、pSE380-MS2-SFTSV和pSE380-MS2-CCHFV转录为RNA，作为评估三种RNA的模板集成样本检测系统的设计与现有针对均质临床标本优化的多重POCT平台不同，我们的系统专门针对复杂节肢动物媒介进行设计。本研究开发的集成现场检测系统结合了三个组件：出口处集成过滤网的一次性研磨管、基于微流控技术的现场可用核酸检测卡盒，以及便携式全自动核酸分析仪（图1A）。过滤结论与局限性本研究提出了一种集成、现场可部署的平台，结合现场蜱虫均质化、核酸提取和多重qPCR，同时检测四种高优先级蜱传播病原体（TBEV、SFTSV、CCHFV和AP）。整个"样本到结果"工作流程在42分钟内完成，检测限低至每毫升1122至2413个拷贝，与参考方法的一致性达到98.45%。这些特性使集成样本检测系统资助本研究由中国国家重点研发计划资助（编号：2026ZD01909302，2021YFC2401000）。利益冲突作者声明不存在利益冲突。作者贡献声明姜家富：资源，方法论。宋甘宜：调查。李明瑞：验证，方法论。黄元：方法论。刘成娟：验证，资源。刘伟：资源，概念化。张小爱：资源。江涛：软件，项目管理，概念化。李向东：监督，概念化。金新浩：软件，形式分析。张明珠：资源，方法论。谭浩南：可视化，验证，资源。蒋鹏冲：软件，形式利益冲突声明作者声明不存在已知的可能影响本文报告工作的竞争性经济利益或个人关系。Lele Shao|Yuchang Li|Chengjuan Liu|Mingrui Li|Jiafu Jiang|Mingzhu Zhang|Xinhao Jin|Pengchong Jiang|Haonan Tan|Yuehong Chen|Sen Zhang|Jing Li|Ye Feng|Yuan Huang|Ganyi Song|Xiaoai Zhang|Wei Liu|Xiangdong Li|Tao Jiang|Xiaoping Kang