基于UT-7细胞系的重组人促红细胞生成素效力评价体外生物分析方法的开发与验证

《Talanta Open》：Development and validation of a UT-7-based in vitro bioassay for potency evaluation of recombinant human erythropoietin

　　

促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）是参与红细胞生成最重要的生长因子，其重组人形式（recombinant human EPO，rHuEPO）目前被广泛用于多种临床适应症的治疗，包括慢性肾脏病相关贫血、失血以及放化疗诱导的骨髓发育不良等。EPO是一种酸性糖蛋白，主要在肾脏肾小管周围细胞中合成，少量在肝细胞中产生。EPO的分子量约为30–34 kDa，糖基化分子约含40%的碳水化合物，具有复杂的N-连接型聚糖结构。转录调控因子缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）负责调控EPO的表达。在正常条件下，HIF-α亚基组成性产生，但会被HIF脯氨酰羟化酶迅速羟基化，随后通过Von Hippel-Lindau（VHL）复合物降解，从而阻止其激活EPO基因的转录。血清血红蛋白（haemoglobin，Hb）水平降低、外周组织耗氧量增加或肾灌注减少均可诱导肾脏产生EPO，组织缺氧是主要的生理刺激因素。EPO与其细胞表面受体（EPOr）相互作用后，信号转导与转录激活因子5（signal transducer and activator of transcription-5，STAT5）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositol 3′-kinase，PI3K）、MAP激酶（MAP kinase，MAPK）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路被激活，这些信号通路通过级联效应促进红系祖细胞的存活、分化和增殖。EPO的体内生物活性与其血清半衰期密切相关，而半衰期又取决于其碳水化合物结构，尤其是三叉和四叉糖链末端的唾液酸残基数量。基于这些特性，EPO在临床上被广泛使用，并通过重组DNA技术生产，最常在中华仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞中表达。研究表明，EPO生产的宿主细胞选择、培养条件和纯化工艺可能影响糖基化谱，最终影响分子的体内生物活性。虽然rHuEPO在肽段序列上与天然EPO结构同质，但不同制剂之间在碳水化合物部分存在异质性。值得注意的是，末端唾液酸化程度的差异可导致不同的比活性。具有不同糖基化模式的rHuEPO药物获批用于临床，对开发统一的体外控制方法提出了重大挑战，该方法需能有效评估多种市售产品的效力，而不受其糖基化谱的影响。目前，欧洲药典（European Pharmacophemacopoeia，pH. Eur.）专论01/2019:1316中报告的用于人用浓缩EPO溶液的金标准控制方法是基于多红细胞增多症小鼠网织红细胞增殖的体内测定（方法A）和正常红细胞小鼠中的测定（方法B）。鉴于当前背景，开发rHuEPO效力检测的替代体外测定方法代表了支持在质量控制活动中逐步减少动物使用策略的重要一步，符合其他生物制药的类似方法，并与3Rs原则（替代、减少、优化，Replacement, Reduction, Refinement）一致。考虑到rHuEPO产品的巨大市场需求，提供关于作用机制可靠信息的体外测试的可获得性，将为生产企业和官方控制实验室带来显著的时间和成本优势。迄今为止，此方向的努力受到以下观察的限制：体外效力测量可能受产品特异性糖基化谱的影响，其影响并不总是与体内测试结果相关。然而，设计良好且经过适当验证的体外测定可提供关于受体介导活性的有意义且互补的信息，支持其在特定监管环境下的整合分析策略中使用。在本研究中，研究人员报告了基于UT-7细胞的rHuEPO效力测定体外生物分析方法的开发和验证，该方法依赖于促红细胞生成素敏感细胞系的增殖反应。该方法的分析性能通过符合ICH Q2(R2)的验证进行评估，并使用不同市售rHuEPO产品初步评估其适用性。该测定作为整合质量控制策略中补充工具的潜在作用，及其当前的局限性和未来监管使用的展望，均进行了讨论。

基于UT-7细胞系的重组人促红细胞生成素效力评价体外生物分析方法的开发与验证——论文解读

一、研究背景与意义

促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）是调控红系造血最关键的生长因子，其重组人形式（recombinant human erythropoietin，rHuEPO）广泛用于慢性肾脏病相关贫血、失血及放化疗所致骨髓抑制等临床适应症的治疗。EPO为酸性糖蛋白，分子量约30–34 kDa，糖基化部分约占40%，含有复杂的N-连接型聚糖。EPO的体内生物活性与其血清半衰期密切相关，后者取决于糖链末端唾液酸残基的数量。由于rHuEPO由不同宿主细胞（如中华仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞）表达，培养条件和纯化工艺的差异会导致糖基化谱的异质性，进而影响产品的比活性。目前欧洲药典（pH. Eur.）专论01/2019:1316规定的rHuEPO效力检测金标准方法为基于多红细胞增多症小鼠和正常红细胞小鼠的体内生物学测定，该方法涉及动物使用，耗时且成本高昂。鉴于具有不同糖基化特征的多种rHuEPO产品获批上市，开发一种不受糖基化谱影响的统一体外效力检测方法具有重要监管意义，同时符合3Rs原则（替代、减少、优化），有助于在质量控制活动中逐步减少动物使用。因此，本研究旨在开发并验证一种基于UT-7细胞系的rHuEPO体外效力生物分析方法，作为体内测定的补充工具，用于上市后批次监测。

二、主要技术方法

研究人员开发并验证了一种基于UT-7人巨核细胞白血病细胞系的体外增殖生物分析方法。首先，将UT-7细胞在含EPO化学参考标准品（EPO CRS）的培养条件下进行约六个月的适应性培养，筛选出高表达促红细胞生成素受体（EPOr）的EPO敏感亚系（UT-7 EPO），同时以GM-CSF维持的UT-7 GM亚系作为平行对照。采用Western blot和流式细胞术分别评估EPOr总蛋白表达水平和细胞表面表达比例。效力测定采用四参数逻辑（4PL）模型分析九点二倍稀释系列的剂量-反应曲线，以CellTiter-Blue荧光法检测细胞增殖。方法验证遵循ICH Q2(R2)指南，涵盖特异性、准确度、精密度（重复性和中间精密度）、线性、范围和稳健性。样本包括EDQM提供的EPO CRS和EPO生物学参考品（EPO BRP）、HEK 293细胞来源的rHuEPO（EPO HEK）、辉瑞公司提供的EPO ζ以及实验室内部制备的热应激EPO聚集体制备物（EPO agg.）。

三、研究结果

3.1 细胞培养策略与EPO敏感UT-7亚系的筛选

Western blot分析显示，UT-7 EPO细胞中EPOr表达随时间（2、3、6个月）逐渐增加，6个月后趋于稳定，而UT-7 GM细胞中EPOr仅呈痕量表达。流式细胞术进一步证实UT-7 EPO亚系细胞表面EPOr表达阳性细胞比例显著高于UT-7 GM亚系。CD13和CD15标志物无显著变化，确认了两个亚系均保持UT-7的造血表型。增殖实验表明，经6个月条件培养后，UT-7 EPO亚系对EPO CRS的增殖反应增幅比UT-7 GM亚系高264.78%，表明EPO条件培养有效筛选出对促红细胞生成素高度敏感的细胞群体。

3.2 方法验证

3.2.1 特异性

以IL-2、IL-5、VEGF和GM-CSF等细胞因子进行特异性评估，结果显示这些因子均未诱导UT-7 EPO细胞的剂量依赖性增殖反应，而EPO CRS和EPO BRP则产生高度可比的剂量-反应曲线。热应激制备的EPO agg.仅表现出约10%的效力反应，表明该方法能够区分生物活性EPO与结构改变的EPO形式。GM-CSF虽能诱导明显更强的增殖反应，但其反应幅度与EPO诱导的反应清晰可辨，证明该方法可区分不同UT-7反应性生长因子。

3.2.2 准确度

以EPO BRP（理论值2000 IU/mL）为靶标，在9个分析日进行准确度评估，总体平均回收率为97.10%（95%置信区间：93.32–100.86），符合预设的80%–120%接受标准，且与理论值无显著差异（单样本Student's t检验，p=0.169）。

3.2.3 精密度

采用单因素随机ANOVA模型（REML选项）计算方差组分。EPO HEK的重复性RSD%为14.0%，中间精密度RSD%为14.0%；EPO ζ的重复性RSD%为7.5%，中间精密度RSD%为12.1%；EPO BRP 100%靶标浓度的重复性RSD%为10.4%，中间精密度RSD%为10.5%。所有结果均满足预设接受标准（重复性RSD%≤20%，中间精密度RSD%≤25%）。

3.2.4 方法线性与范围

在靶标浓度50%至150%范围内进行线性评估，以理论值为自变量对21个观测值进行线性回归，回归高度显著（p=2E?16），决定系数R2=0.98，回归方程为y=?10.86+1.09x，所有数据点均落在95%预测区间内。结合所有浓度水平下精密度和准确度均满足接受标准，方法范围确认为靶标浓度的50%–150%。

3.2.5 稳健性

通过改变细胞代数（第13、17、18代）、EPO孵育时间（44小时）以及底物读取孵育时间（6、7、8小时和过夜）进行评估，所有条件下的回收率均落在80%–120%的预设接受标准内。

四、讨论与结论

研究人员讨论了该体外生物分析方法在整合质量控制策略中的补充作用。该方法能够特异性检测EPOr介导的生物学活性，可区分rHuEPO与无关细胞因子和生长因子，并识别结构改变的EPO形式。方法的精密度和准确度均满足预设标准，线性范围覆盖靶标浓度的50%–150%。研究人员指出，体外效力测量可能受产品特异性糖基化谱影响，其与体内测试结果的相关性需进一步评估。然而，经过充分设计和验证的体外测定可提供受体介导活性的有意义信息，支持其在特定监管环境下作为体内测定的补充工具使用。研究结论为：该基于UT-7 EPO亚系的体外生物分析方法经过ICH Q2(R2)合规验证，适用于rHuEPO制剂的效力测定，可作为上市后批次监测中体内测定的动物替代补充方法，支持整合分析策略的实施。该方法的当前局限性包括对市售产品适用性的初步评估仍需扩大样本验证，以及其与体内效力结果的相关性需在更广泛的监管框架中进一步确认。未来研究可探索该方法在不同糖基化谱rHuEPO产品中的更广泛应用，以推动其监管认可。