综合体外实验与计算机模拟方法评估夏枯草种子油的安全性和促伤口愈合潜力

《Toxicology in Vitro》：An integrated in vitro and in silico approach to evaluate the safety and wound healing potential of Dracocephalum moldavica L. seed oil

　　

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  应用 OECD TG 432 和 TG 439 进行局部安全性评估。
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  DMS 被归类为非光毒性和非刺激性。
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  在 2D 和 3D 模型中观察到浓度依赖性的再生作用。
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  HaCaT 角质形成细胞中的炎症性 IL-6 反应受到调节。
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  体外和计算机模拟研究结果支持其生物学合理性。

引言

Dracocephalum moldavica L. (DM)，俗称龙头草，是唇形科的一种多年生草本植物。其自然分布于从中亚到东欧和中欧，传统上用于草药配方治疗皮肤病 (Dastmalchi et al., 2007a; Dastmalchi et al., 2007b; Naderifar et al., 2015)。众多研究已确立其抗氧化、抗炎和抗菌特性，以及神经保护和心脏保护效果 (Jiang et al., 2014; Jiang et al., 2020)。

DM 种子也因作为富含营养的植物资源而备受关注，这主要归功于其脂质成分和多酚类化合物 (Song et al., 2021)。在我们之前的研究中，通过超临界 CO₂ 提取获得的 DM 种子油 (DMS) 经 GC-FID 进行了化学表征，显示出以不饱和脂肪酸为主的风味谱（约占脂肪酸总量的 90%），主要由 α-亚麻酸 (ALA; 约 61–62%) 和亚油酸 (LA; 约 18%) 驱动，ω-3:ω-6 比例为 3:1 (Song et al., 2021)。在同一分析中，植物甾醇被鉴定为主要微量脂质成分，其中麦角甾醇和 β-谷甾醇 (+ 岩藻甾醇) 是超临界 CO₂ 油中占主导地位的甾醇。为了加强用于毒理学解释的材料定义，本研究使用的 DMS 批次的化学指纹总结在表 S1 中，以供参考表征。

从皮肤美容角度来看，富含 ω-3 的脂肪酸与皮肤屏障脂质成分和炎症介质谱的调节有关，而植物甾醇已被纳入化妆品配方中，用于屏障恢复和支持对抗紫外线相关的皮肤压力 (Offerta et al., 2016; Puglia and Bonina, 2008)。然而，尽管有成分上的理由，DMS 在具有人类相关性的替代模型中的光毒安全谱和浓度依赖性再生窗口对于实际化妆品开发而言仍未得到充分定义。

长期暴露于紫外线 (UV) 辐射对皮肤有关键影响，主要通过光毒性机制诱导活性氧 (ROS) 产生和氧化应激。因此，评估植物成分的光毒安全性是化妆品开发的前提 (Da et al., 2019; Kobayashi et al., 2023)。与安全性评估并行，消费者对旨在预防和管理光老化的天然化妆品和药品的偏好日益增长，导致动物模型在毒性和光毒性测试中得到了广泛应用。然而，关于在有效性和安全性评估中过度使用动物的伦理和社会担忧，导致许多国家限制动物测试 (Meigs et al., 2018)。自 2013 年欧洲联盟 (EU) 引入对化妆品动物测试的完全禁令以及禁止销售经动物测试的化妆品产品以来，经济合作与发展组织 (OECD) 指导下提出了各种替代测试方法，包括体外和计算机模拟模型。尽管有这些优势，这些替代方法在准确复制免疫反应和代谢途径方面仍存在局限性，强调了像重组人表皮 (RHE) 这样先进模型的需要 (Doke and Dhawale, 2015)。

据我们所知，此前没有研究系统地评估过使用与 OECD 对齐的非动物替代测试方法对 DMS 的光毒性和皮肤刺激潜力。因此，本研究旨在使用集成的替代测试框架评估 DMS 的局部安全性和再生合理性。使用符合 OECD TG 432 (OECD, 2019) 的 3T3-NRU 测试检查光毒潜力，并使用符合 OECD TG 439 的 RHE 模型评估皮肤刺激。此外，使用 2D 角质形成细胞划痕实验和体外 3D 重组人皮肤伤口模型研究了 DMS 的伤口愈合能力，以捕获浓度依赖性的组织水平反应。最后，使用探索性的基于网络的计算机模拟分析来检查 DMS 相关化合物 (表 S1) 是否与观察到的体外结果一致的皮肤相关候选生物过程有关。

部分摘录

样品提取

DM 种子取自香港观塘的种子区。凭证标本已在明济大学认证并存入，登录号为 MJU-18-HWANG-DMS。细磨的 DM 种子按照 Song 等人之前描述的方法使用超临界流体提取 (SFE) 进行提取 (Song et al., 2021)。简而言之，将 10 g DM 种子粉末置于 SFE 系统 (Ilshin Autoclave, Daejeon, Korea) 的提取容器中。经冷却器冷却的液态二氧化碳 (CO₂)，被

使用体外 3T3-NRU 测试进行光毒性评估

为了评估紫外线暴露下 DMS 的皮肤安全性，根据 OECD TG 432 (OECD, 2019) 进行了体外 3T3-NRU 光毒性测试。阳性对照物氯丙嗪 (CPZ)，一种特征明确的光毒剂，表现出强烈的光毒性 (PIF = 80.09; MPE = 0.325)，这两个值均超过了 OECD 光毒性分类阈值 (PIF > 5 或 MPE > 0.15)。相比之下，DMS 表现出 PIF 值为 1.119 和 MPE 值为 0.125，均低于

讨论

本研究提供了对超临界流体提取的 DMS 的皮肤安全性和伤口愈合潜力的全面评估，结合了与 OECD 对齐的光毒性和皮肤刺激试验以及互补的非动物模型。我们的结果表明，DMS 在测试条件下是非光毒性和非刺激性的，同时在模型特定的最佳浓度范围内表现出浓度依赖性的再生活性。结合 2D 角质形成细胞实验，一种

结论

本研究证明，在 OECD TG 432 和 TG 439 试验的测试条件下，超临界 CO? 提取的Dracocephalum moldavica L. 种子油被归类为非光毒性和非刺激性。在最佳浓度范围内，DMS 促进了 2D 角质形成细胞和 3D 重组皮肤模型中的表皮再生，而较高浓度下再生活性降低突出了浓度优化重要性。互补的基于网络的计算机模拟

CRediT 作者贡献声明

Eunsu Song: 撰写 – 初稿，可视化，方法论，正式分析，数据整理。Haemin Lee: 撰写 – 初稿，可视化。Jinah Hwang: 撰写 – 审阅与编辑，监督，资金获取，概念化。

伦理声明

已从所有参与者或其法定代理人处获得参与本研究并发布文章的书面知情同意。参与者的隐私权已得到尊重。

本研究包括器官或组织捐赠者。本研究包括人体生物材料，捐赠者或其亲属或法定代理人已获得同意，同意将这些材料用于本研究并发布文章。本研究中使用的样品并非来源于被处决者

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的相互冲突的财务利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本报告中描述的工作。

致谢

本工作得到了由韩国国家研究基金会 (NRF) 资助，科学部 提供支持的拨款 (项目编号 2017R1A2B4010140 和 2021R1A2C1012890)。

Eunsu Song|Haemin Lee|Jinah Hwang