《Foods》：From Efficacy to Process: Uric-Acid-Lowering Effect of Limosilactobacillus reuteri W6-12 and Its Production Process Optimization
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临床用于高尿酸血症（HUA）的化学药物常引起肝肾功能损伤等副作用。开发安全有效的益生菌制剂用于HUA干预具有重要的应用价值。然而，益生菌的大规模生产面临两大瓶颈：发酵过程中活菌密度低以及冻干后存活率差。本研究将罗伊氏乳杆菌（Limosilactobacillu
临床用于高尿酸血症（HUA）的化学药物常引起肝肾功能损伤等副作用。开发安全有效的益生菌制剂用于HUA干预具有重要的应用价值。然而，益生菌的大规模生产面临两大瓶颈：发酵过程中活菌密度低以及冻干后存活率差。本研究将罗伊氏乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）W6-12的体内功效评价与机制探索及其生产工艺优化相结合。研究人员首先验证了该菌株的体内降尿酸效果，随后采用响应面法（RSM）优化发酵培养基组分和复合冻干保护剂配方，并进一步利用HUA大鼠模型评价所得冻干益生菌粉的功效。在HUA大鼠中，W6-12处理显著降低血清尿酸（SUA）水平，该效应归因于肝脏黄嘌呤氧化酶（XOD）抑制和肾脏葡萄糖转运蛋白9（GLUT9）及尿酸盐转运蛋白1（URAT1）下调、肾脏氧化应激和炎症的减轻，以及肠道微生物组成及相关代谢物的重塑，可能通过肠道菌群-胆汁酸轴发挥作用。优化后的培养基（蔗糖31 g/L、酵母提取物26 g/L、乙酸钠7.5 g/L）获得2.03 × 109 CFU/mL的活菌数，较未优化条件提高1.6倍。最优复合冻干保护剂由8% L-谷氨酸钠、10%海藻糖和12%脱脂乳粉组成，冻干存活率达89.47%。低、中、高剂量的冻干W6-12粉剂在HUA大鼠中均发挥剂量依赖性的降尿酸作用。综上所述，L. reuteri W6-12冻干粉是一种具有前景的用于尿酸（UA）管理的益生菌制剂。
一、研究背景与意义
高尿酸血症（HUA）是一种由嘌呤代谢功能障碍驱动的慢性代谢性疾病，以血清尿酸（SUA）水平异常升高为特征。全球HUA患病率持续上升，已成为继高血压、高脂血症和高血糖之后的第四大常见慢性代谢疾病，其发病率仅次于糖尿病，给公共卫生系统带来沉重且持续的负担。临床和流行病学证据表明，HUA不仅是痛风及痛风性关节炎的关键致病因素，还通过代谢紊乱、氧化应激和炎症失衡加速慢性肾病、心血管损伤和2型糖尿病的进展。目前临床干预HUA主要依赖黄嘌呤氧化酶（XOD）抑制剂和促尿酸排泄药物，以别嘌醇、非布司他和苯溴马隆为代表。尽管这些药物具有确切的降尿酸疗效，但长期用药可导致肝肾功能损伤、过敏反应和耐药性等不良反应，部分患者因临床不耐受而需停药，极大限制了传统HUA疗法的适用人群。在此背景下，探索安全、温和、可长期实施的膳食干预策略已成为功能性食品开发和代谢营养学领域的研究热点。益生菌具有优异的生物安全性和多靶点代谢调控特性，是改善尿酸（UA）代谢和缓解全身代谢紊乱的理想膳食功能因子。
罗伊氏乳杆菌（L. reuteri）是一种具有益生特性的乳酸菌，可稳定定植于人类和动物肠道，已被列入中国《可用于食品的菌种名单》并获得国际公认的食品级安全益生菌地位，在发酵食品制造和功能性膳食补充中应用广泛。多项研究已证实L. reuteri通过多种途径缓解HUA症状，包括降解嘌呤核苷前体（肌苷和鸟苷）、抑制XOD活性、重塑失调的肠道菌群以及维持肠道代谢稳态。然而，益生菌的功能特性具有严格的菌株特异性，不同菌株在嘌呤降解能力、胁迫耐受性和体内代谢调控机制方面存在显著差异，已有研究结论不能普遍推广至新分离菌株，特定菌株的体内干预效果和内在分子机制仍需系统探索。
当前全球降尿酸益生菌研究主要集中在菌株资源挖掘、体外功能评价和体内调控机制初步探究，但对连接实验室功能验证与大规模工业化生产的转化研究关注不足，这是制约降尿酸益生菌产品产业化的重大技术瓶颈。高密度液体发酵是益生菌低成本、大规模工业化生产不可或缺的工序。常规MRS培养基因原料成本高和批次发酵性能不稳定而不适合工业化生产。真空冷冻干燥是益生菌商业化保存和应用的核心加工技术，但冻干过程中冰晶形成和持续水分流失会破坏细胞膜完整性并引发胞内蛋白质不可逆变性，大幅降低细菌存活率并损害益生菌的功能稳定性。合理配制的复合冻干保护剂体系可有效缓解冻干诱导的细胞应激，对高质量冻干益生菌粉的制备至关重要。此外，发酵培养基组分直接调节细菌细胞膜脂肪酸谱和胞内相容性溶质的积累，从而改变菌株的胁迫抗性，表明发酵与冻干工艺之间存在紧密耦合关系。因此，对发酵培养基配方和复合冻干保护剂体系进行系统集成优化，对于工业化制备高活性降尿酸冻干益生菌粉至关重要。
二、研究内容与结论
研究人员此前从传统藏区奶渣中分离筛选出一株L. reuteri W6-12，体外实验证实该菌株能高效降解肌苷、鸟苷和腺苷等嘌呤核苷，显示出降尿酸活性潜力。本研究首先建立HUA大鼠模型，系统评价W6-12的体内降尿酸能力和肾脏保护作用；随后采用16S rRNA测序结合血清和粪便非靶向代谢组学阐明菌株介导的肠道菌群与代谢物之间的调控网络；在此基础上，利用响应面法（RSM）优化发酵培养基和复合冻干保护剂配方，建立具有进一步放大潜力的高密度、高存活率冻干益生菌粉制备工艺；最后，将梯度剂量的冻干益生菌粉给予HUA模型大鼠，验证其降尿酸效应的剂量-反应关系并评价菌株经发酵和冻干后的功能保留情况。本研究旨在构建覆盖菌株功能验证、工艺优化和成品功效评价的完整技术体系，为降尿酸益生菌功能性食品的进一步开发提供可靠的实验证据和技术参考。
三、主要关键技术方法
本研究采用的关键技术方法包括：大鼠HUA模型建立（通过灌胃氧嗪酸钾和次黄嘌呤混合悬液诱导）；16S rRNA高通量测序（委托上海美吉生物医药科技有限公司完成）；血清和粪便非靶向代谢组学分析（基于UPLC-MS/MS平台，结合人类代谢组数据库HMDB进行代谢物注释）；响应面法（RSM）中的Plackett-Burman设计和Box-Behnken设计（用于发酵培养基和冻干保护剂配方优化）；真空冷冻干燥技术；组织病理学检查（苏木精-伊红HE染色和Masson三色染色）；Spearman相关分析和Mantel检验（用于多组学关联分析）。
四、研究结果
4.1 W6-12对HUA大鼠SUA水平及肾功能的影响
经氧嗪酸钾和次黄嘌呤灌胃后，HUA大鼠SUA水平显著高于对照组，表明HUA大鼠模型建立成功。经W6-12灌胃干预四周后，升高的SUA水平较HUA组显著逆转，表明L. reuteri W6-12具有体内降尿酸作用。HUA组血清肌酐（CRE）和血尿素氮（BUN）水平较对照组显著升高，而W6-12补充有效降低血清CRE和BUN含量，表明W6-12可改善高尿酸血症引发的肾损伤。肾脏组织病理学染色进一步验证了W6-12的肾脏保护特性：HE染色显示HUA组出现典型病理损伤，包括明显的肾小管空泡变性、肾小管扩张和广泛炎性细胞浸润，W6-12处理显著恢复肾小管结构完整性并缓解肾脏病理损伤和炎症浸润；Masson染色显示HUA组出现显著的间质胶原沉积和纤维化病变，W6-12补充显著减少胶原积累并抑制肾纤维化进展。
4.2 W6-12对肝脏嘌呤代谢酶活性和肾脏尿酸盐转运蛋白水平的影响
HUA组肝脏XOD活性较对照组显著升高，W6-12干预减弱了这一升高。HUA组腺苷脱氨酶（ADA）活性显著高于对照组，W6-12处理虽有所降低但未达统计学显著水平，表明W6-12主要通过靶向抑制XOD活性来调节内源性UA合成。肾脏尿酸盐转运蛋白方面，HUA组肾GLUT9和URAT1蛋白水平显著高于对照组，W6-12干预后两者均显著降低，表明肾小管尿酸盐重吸收受到抑制，UA排泄得到促进。综上，W6-12通过抑制肝脏UA合成和阻断肾脏尿酸盐重吸收两条协同途径发挥降尿酸作用。
4.3 W6-12对肾脏氧化应激和炎症细胞因子水平的影响
HUA组肾脏活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平较对照组显著升高，W6-12干预显著降低肾脏ROS和MDA积累，有效改善氧化应激损伤。HUA组肾脏白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）浓度显著升高，W6-12处理显著降低这两种促炎因子的丰度。W6-12干预可同时缓解肾脏氧化应激并抑制局部炎症反应，打破氧化损伤与炎症之间的恶性循环，最终改善高尿酸血症引起的肾损伤。
4.4 W6-12对HUA大鼠肠道菌群结构的影响
16S rRNA高通量测序结果显示，HUA组Chao1、ACE和Sobs指数显著降低，W6-12干预后未显著恢复，表明高尿酸应激导致肠道微生物丰富度不可逆丧失。HUA组Shannon指数降低、Simpson指数升高，W6-12处理将Shannon指数恢复至接近正常水平并相应降低Simpson指数，表明W6-12有效改善肠道微生物群落均匀度。主成分分析（PCA）显示三组间沿主坐标轴呈清晰空间分离，W6-12干预有效逆转了HUA引起的微生物失调。属水平分析显示，HUA组乳酸杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）相对丰度显著上调，而产丁酸菌属包括瘤胃球菌属（Ruminococcus）、NK4A214_group和norank_f_[Eubacterium]coprostanoligenes_group显著下调。W6-12干预后，HUA组异常升高的Lactobacillus丰度被有效逆转，耗竭的产丁酸菌属显著恢复；同时，具有嘌呤降解潜力的李格氏乳酸杆菌属（Ligilactobacillus）在W6-12组达到峰值。这些结果表明W6-12通过多方面调节重塑了HUA大鼠紊乱的肠道微生态。
4.5 W6-12对HUA大鼠血清和粪便代谢物的影响
血清代谢组学分析显示，HUA组与对照组间鉴定出463种差异代谢物，主要富集于赖氨酸生物合成、精氨酸生物合成、苯丙氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢及组氨酸代谢通路；W6-12组与HUA组间鉴定出560种差异代谢物，富集通路包括赖氨酸代谢、初级胆汁酸（BA）生物合成、不饱和脂肪酸生物合成和类固醇激素生物合成。粪便代谢组学分析显示，HUA组与对照组间鉴定出1705种差异代谢物，核心富集通路包括核苷酸代谢、类固醇生物合成、嘌呤代谢、淀粉和蔗糖代谢及磷酸戊糖途径；W6-12干预后鉴定出582种差异代谢物，主要富集于淀粉和蔗糖代谢、甲烷代谢和嘌呤代谢等通路。胆汁酸（BA）分析显示，HUA组血清初级胆汁酸胆酸（CA）和鹅去氧胆酸（CDCA）水平升高而粪便水平降低，呈现典型的胆汁酸肠肝循环淤滞模式；W6-12干预后血清CA和CDCA水平下降而粪便水平升高，表明初级胆汁酸的正常排泄节律得到恢复。W6-12介导的肠道菌群重塑改变了BA转化通量，大量CA以游离形式排出，减少了微生物7α-脱羟基作用的底物，从而降低脱氧胆酸（DCA）的产生。
4.6 肠道菌群-胆汁酸-UA代谢轴的多组学关联分析
Spearman相关分析显示，Lactobacillus丰度与SUA浓度、肝脏XOD活性、血清IL-6和IL-1β、肾脏MDA含量及肾脏尿酸盐转运蛋白GLUT9和URAT1显著正相关，与血清累积的初级和次级胆汁酸正相关，与多种粪便排泄性胆汁酸负相关。相反，瘤胃球菌属（Ruminococcus）、NK4A214_group、norank_f_[Eubacterium]coprostanoligenes_group等产丁酸菌属及多种其他菌属与SUA水平、肝脏XOD活性和血清胆汁酸丰度显著负相关，这些菌属在HUA大鼠中耗竭而在W6-12干预后恢复。Mantel检验全局关联网络分析显示，HUA组在UA代谢、炎症反应和BA稳态方面出现全面扰动，W6-12干预有效挽救了大部分HUA诱导的代谢异常，但W6-12组与对照组之间仍存在明显代谢差异，表明W6-12治疗实现了部分而非完全的生理代谢稳态恢复。基于观察到的BA谱变化和肝脏XOD活性降低，结合现有关于BA相关信号通路的文献，研究人员推测W6-12可能通过涉及肠-肝轴的BA相关通路发挥降尿酸作用，但FXR、FGF19/FGF15和CYP7A1未被直接测定，该机制仍需直接分子证据加以证实。
4.7 液体发酵培养基的响应面优化
单因素实验确定蔗糖为最优碳源（最适浓度30 g/L）、酵母提取物为最优氮源（最适浓度26 g/L），并确定了缓冲盐、微量元素和吐温-80的最适浓度。Plackett-Burman筛选出蔗糖、酵母提取物和乙酸钠为影响活菌数的三个最显著因素。Box-Behnken设计建立二次多项式回归方程，模型预测最优培养基配方为蔗糖30.90 g/L、酵母提取物26.17 g/L、乙酸钠7.35 g/L，理论最大活菌数为1.97 × 109 CFU/mL。结合实际操作便利性修正为蔗糖31.00 g/L、酵母提取物26.00 g/L、乙酸钠7.50 g/L，三组平行验证实验测得平均活菌数达2.03 × 109 CFU/mL，与预测值无显著差异，较未优化条件提高1.6倍。
4.8 冻干保护剂的响应面优化
对17种候选冻干保护剂进行筛选，L-谷氨酸钠、脱脂乳粉和海藻糖表现出显著优于其他保护剂的冻干存活率，分别为80.85%、81.88%和78.96%。单因素实验确定三种保护剂的最适浓度分别为8% L-谷氨酸钠、10%海藻糖和12%脱脂乳粉。Box-Behnken设计优化得到最优复合保护剂配方为8.62% L-谷氨酸钠、9.54%海藻糖和12.61%脱脂乳粉，预测存活率为89.03%。修正为8.00% L-谷氨酸钠、10.00%海藻糖和12.00%脱脂乳粉后，多次重复验证实验获得平均存活率89.47%，与预测值无显著偏差。
4.9 冻干菌粉的体内功效验证
将经优化发酵和冻干工艺制备的W6-12冻干粉以不同剂量给予HUA大鼠，结果显示冻干粉对SUA水平产生剂量依赖性降低作用。低、中、高剂量W6-12粉剂均显著降低血清CRE和BUN水平，表明高尿酸血症引起的肾损伤得到减轻。HE染色显示，高剂量W6-12粉剂干预后肾小管结构完整性显著恢复，肾脏炎症病变和细胞变性明显缓解。这些结果证实，经优化发酵和冻干保护剂工艺制备的W6-12冻干粉在体内保留了显著的降尿酸和肾脏保护特性，且随粉剂剂量增加生理效应增强，呈现清晰的剂量依赖性模式。
五、讨论与结论
本研究系统评价了L. reuteri W6-12的降尿酸作用并优化了其生产工艺。W6-12显著降低HUA大鼠SUA水平并减轻肾损伤，主要通过抑制肝脏XOD活性、下调肾脏GLUT9和URAT1、减轻肾脏氧化应激和炎症实现。16S rRNA测序和非靶向代谢组学进一步揭示，W6-12逆转了肠道菌群失调，降低与HUA严重程度相关的Lactobacillus及相关菌属丰度，同时恢复产丁酸菌属，缓解胆汁酸肠肝循环淤滞，并调节血清和粪便代谢物谱。多组学关联分析提示这些效应可能涉及肠道菌群-胆汁酸轴，可能通过FXR-FGF19信号通路发挥作用；然而，FXR、FGF19/FGF15和CYP7A1未被直接测定，该推测机制仍需直接分子证据加以证实。与此同时，研究人员建立了最优发酵培养基和最优复合冻干保护剂，分别实现2.03 × 109 CFU/mL的活菌数和89.47%的冻干存活率，所得冻干粉在HUA大鼠中表现出剂量依赖性的降尿酸活性。本研究仍存在局限性：实验在实验室规模进行，且仅限于化学诱导的大鼠模型；W6-12的功效、安全性、最佳人用剂量和临床相关性尚待确定；需要更大样本量的动物实验进一步验证；工业化应用前还需评估放大性能、批次间重现性、生产产量、工艺经济性、储存稳定性和长期活力。此外，还需要额外的毒理学和安全性研究、其他模型的独立验证以及人体临床试验，才能全面评估W6-12的转化潜力。
