《Foods》：An Innovative Blend of Cinnamon Essential Oil, Roselle, and Moringa Flower Powders as a Natural Alternative to Sodium Nitrite in Chicken Sausage Processing
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摘要：在加工肉类中使用亚硝酸盐和硝酸盐是一个公共卫生问题，因为它们可能形成潜在致癌的N-亚硝基化合物。本研究开发并表征了一种由玫瑰茄花粉末、辣木花粉末和肉桂精油按5.5:4:0.5比例组成的天然植物化学配方，作为乳化型鸡肉香肠中潜在的亚硝酸盐替代品。该配方表现
摘要：在加工肉类中使用亚硝酸盐和硝酸盐是一个公共卫生问题，因为它们可能形成潜在致癌的N-亚硝基化合物。本研究开发并表征了一种由玫瑰茄花粉末、辣木花粉末和肉桂精油按5.5:4:0.5比例组成的天然植物化学配方，作为乳化型鸡肉香肠中潜在的亚硝酸盐替代品。该配方表现出强大的抗氧化活性，具有高总酚含量（147.44 mg GAE/g）和有效的DPPH自由基清除能力。气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析初步鉴定出多种生物活性次生代谢物。该配方还对主要食源性病原体表现出广谱抗菌活性，并在不同pH值（2-6）和温度（37-100 °C）条件下保持稳定。毒性评估，包括红细胞溶血试验、益生菌相容性试验和Vero细胞细胞毒性试验，证实了其无毒性。将含有不同水平植物化学配方（0-1%）和亚硝酸钠（0-150 ppm）的鸡肉香肠在4 ± 1 °C下储存20天，并定期进行评估。与对照组相比，含有该配方的香肠在保水性（22%对25%）、营养品质（水分=66.02%对67.24%，总灰分=2.09%对2.32%，碳水化合物=2.76%对2.98%）和质地（第0天为1.88对1.80 kgf/cm2，第20天为1.44对1.64 kgf/cm2）方面显著改善（p ≤ 0.05），同时表现出更低的脂质氧化（第0天为0.287对0.278 mg MDA/kg，第20天为2.031对0.761 mg MDA/kg）、残留亚硝酸盐水平（第0天为80.35对31.10 mg/kg，第20天为46.96对16.03 mg/kg）和微生物计数[总活菌数（第0天为1.58对1.28 log CFU/g，第20天为4.65对3.52 log CFU/g），嗜冷菌（第20天为3.56对1.24 log CFU/g），大肠菌群（未检出），金黄色葡萄球菌（第20天为2.55对1.34 log CFU/g）]。尽管完全替代亚硝酸盐会产生不理想的深色，但部分替代（1/2至2/3，即75-100 ppm亚硝酸盐）可维持产品质量和货架期，突显了该配方在开发更清洁标签、更健康的加工肉制品方面的潜力。
研究背景与问题
加工肉制品在现代饮食中占有重要地位，尤其是乳化型熟制鸡肉香肠因其瘦肉偏好、便利性、经济性和理想感官特性而广受欢迎。然而，这类产品的品质、安全性和可接受性高度依赖化学防腐剂，特别是亚硝酸钠。亚硝酸钠在加工肉中发挥着多重功能：赋予特征粉红色（通过形成腌肉色素亚硝基血红蛋白）、抑制脂质氧化以防止酸败和“过热味”、增强风味并抑制病原微生物（尤其是肉毒梭菌）。尽管具有这些有益功能，但加工肉中的亚硝酸盐常与人类健康的不良影响相关联，如食管癌、鼻咽癌、胃癌、结直肠癌、脑癌和膀胱癌，还可导致婴儿高铁血红蛋白血症或“蓝婴综合征”。此外，亚硝酸盐与仲胺的反应是加工和贮藏过程中形成致癌性N-亚硝基化合物的原因。世界卫生组织下属的国际癌症研究机构已将加工肉类列为致癌物（第1类）。过量摄入亚硝酸盐还会引起甲状腺肿大，并可能干扰孕酮合成导致流产。为此，监管机构对肉制品中允许的亚硝酸盐水平实施了严格限制，欧盟规定最大允许限量为150 ppm。同时，消费者对不含合成添加剂的“清洁标签”食品的需求日益增长，一项近期调查显示，由于对健康和保健的关注增加，消费者现在寻求肉制品上的“无亚硝酸盐”标签。
为应对这些挑战，研究人员致力于寻找天然亚硝酸盐替代品。单一的植物成分难以复制合成亚硝酸盐的多功能性（提供抗菌、抗氧化和护色性能），因此探索具有协同效应的植物提取物和精油的理想组合及用量至关重要。此前，研究人员已开发出一种由三种植物成分组成的新型植物化学组合：玫瑰茄花粉末、辣木花粉末和肉桂精油，并初步评估了其在鸡肉香肠中的功效，但未涉及该配方的详细特性，包括抗菌活性、毒性评估及其在降低残留亚硝酸盐的同时维持营养、质构、微生物和感官品质的有效性。
研究内容与结论
本研究对前期开发的植物化学配方（玫瑰茄花粉末:辣木花粉末:肉桂精油 = 5.5:4:0.5）进行了全面的体外表征，包括总可提取组分、pH值、颜色和残留亚硝酸盐含量；利用GC-MS初步鉴定生物活性次生代谢物；基于总酚含量和DPPH自由基清除能力的抗氧化测定；针对常见革兰氏阳性和阴性食源性细菌（包括抗梭菌活性）的抗菌测定、最低抑菌浓度、最低杀菌浓度、DNA降解分析、时间-杀菌曲线和稳定性测定；以及毒性评估（溶血试验、益生菌相容性和Vero细胞细胞毒性试验）。进一步地，研究人员在冷藏条件下（4 ± 1 °C）将配方应用于鸡肉香肠模型系统中评估其作为天然亚硝酸盐替代品的潜力，为期20天。
研究表明，该植物化学配方具有强抗氧化活性（总酚含量147.44 mg GAE/g，DPPH IC50为63.81 μg/mL）、广谱抗菌活性（对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌和生孢梭菌均有效）、良好的热稳定性（37-100 °C）和pH稳定性（pH 2-6），且在4 °C下储存30天仍保持活性。毒性试验证实其无细胞毒性（红细胞溶血率极低，Vero细胞存活率>86%），且不影响益生乳酸菌的生长。在鸡肉香肠应用中，添加该配方（0.25%、0.5%、1%）单独或与化学亚硝酸盐结合，改善了香肠的品质和货架期：提高了保水性和营养品质，降低了脂质氧化和残留亚硝酸盐水平，抑制了微生物生长（总活菌数、嗜冷菌、金黄色葡萄球菌）。虽然完全替代亚硝酸盐会导致产品颜色异常变深，但部分替代（75-100 ppm亚硝酸盐）能够维持产品品质、安全性和货架期。
关键技术方法
研究人员采用的主要关键技术方法包括：
- 1.
植物化学配方制备与筛选：通过混合玫瑰茄花粉末、辣木花粉末和肉桂精油制备三种不同比例的配方，基于稳定性、颜色、抗氧化能力和抗菌活性（抑菌圈直径）进行初步筛选，确定最优比例（5.5:4:0.5）。
- 2.
体外表征：测定总可提取组分、pH值、仪器颜色坐标（L, a, b, 色调角hab，色度Cab）和残留亚硝酸盐含量；采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量，DPPH法测定自由基清除能力；通过GC-MS初步鉴定次生代谢物。
- 3.
抗菌与毒性评估：采用琼脂孔扩散法测定抗菌活性；通过刃天青还原法和滴板法分别测定最低抑菌浓度和最低杀菌浓度；通过琼脂糖凝胶电泳评估DNA损伤；通过时间-杀菌曲线研究生长动力学；在不同温度、pH和储存条件下评估稳定性；通过绵羊红细胞溶血试验、益生菌生长影响试验和Vero细胞MTT试验进行毒性评估。
- 4.
鸡肉香肠应用与评价：制备五种不同处理的鸡肉香肠组（阴性对照、阳性对照含150 ppm亚硝酸盐、三个处理组），在4 ± 1 °C下储存20天。评估指标包括：可榨出水、近似组成和热量值（第0天）；理化品质（TBARS值、残留亚硝酸盐含量、剪切力值、总色素、腌肉色素、腌制效率）；微生物品质（总活菌数、嗜冷菌数、大肠菌群数、金黄色葡萄球菌数）；以及感官品质（颜色外观、风味、质地嫩度、多汁性、总体可接受性）。
研究结果
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配方制备与筛选：三种初始配方（4:4:2, 5.5:4:0.5, 5:4:1）在稳定性、颜色和抗氧化能力上无显著差异，但抗菌活性有显著差异。其中5.5:4:0.5和5:4:1配方抗菌活性最高。最终选择5.5:4:0.5配方，因其肉桂精油比例更低，从感官角度更理想。
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配方表征：
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总可提取组分、pH、颜色和残留亚硝酸盐含量：配方的总可提取组分为26.79%，pH值为3.28（酸性），CIELAB颜色值为L* 21.87, a* 19.88, b* 13.43, hab 6.20, C*ab 25.01，未检测到残留亚硝酸盐。
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抗氧化活性：配方的总酚含量（147.44 mg GAE/g）显著高于合成抗氧化剂BHT和BHA。其DPPH自由基清除能力的IC50值为63.81 μg/mL，低于BHT、BHA和亚硝酸钠，表明其具有良好抗氧化活性。
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GC-MS分析：初步鉴定出30种主要植物化学化合物，包括1-辛醇-3,7-二甲基-（香茅醇）、顺式-1,2-二甲基环己烷等，这些化合物可能贡献了配方的酸性和抗氧化/抗菌活性。
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抗菌活性：配方对多种食源性病原体（包括梭菌）表现出强抗菌活性。对于金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌，最低抑菌浓度和最低杀菌浓度均为0.781 mg/mL，耐受水平为1（杀菌作用）；对鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌也表现出杀菌作用。
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DNA降解：配方处理导致质粒DNA和金黄色葡萄球菌基因组DNA降解，这可能是其抗菌机制之一。
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生长动力学与稳定性：时间-杀菌试验显示，配方在最低杀菌浓度下于9小时内完全消除金黄色葡萄球菌。配方在37-100 °C和pH 2-6条件下保持抗菌活性，但在pH 8时失活；在4 °C下储存30天后仍保持活性。
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毒性评估：溶血试验显示配方在1X至5X最低抑菌浓度下几乎不引起红细胞溶血（<0.37%）。益生菌相容性试验表明配方不影响乳酸菌生长。Vero细胞MTT试验显示，在高达10%（w/v）浓度下，细胞活力仍保持在86%以上，证明其无细胞毒性。
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鸡肉香肠品质评价：
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可榨出水、近似组成与热量值：添加配方的香肠（T3B）可榨出水最低，表明保水性更高。处理组香肠的热量值低于对照组。
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TBARS值与残留亚硝酸盐：储存期间所有样品TBARS值均上升，但处理组上升速度更慢，且始终低于可接受水平（1-2 mg MDA/kg）。处理组（T1B, T2B）的残留亚硝酸盐水平显著低于阳性对照组（C2），且均在Codex标准允许范围内。完全无亚硝酸盐的样品（C1, T3B）中残留亚硝酸盐低于检测限。
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剪切力值：储存期间所有样品剪切力值下降，但处理组（T2B, T3B）在第20天时显著高于对照组，表明其质地保持更好。
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色素与腌制效率：阳性对照组（C2）的腌肉色素和腌制效率最高。处理组的总色素水平较高。随着储存时间延长，腌肉色素和总色素下降，腌制效率降低。
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微生物品质：处理组香肠的总活菌数和嗜冷菌数在整个储存期间均低于对照组，且在第20天时仍符合FSSAI标准。所有样品均未检出大肠菌群。处理组的金黄色葡萄球菌数在储存结束时仍在可接受范围内，而对照组在第15天已超标。
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感官品质：处理组（T1B, T2B）在颜色、风味、质地、多汁性和总体可接受性方面得分较高。完全替代亚硝酸盐的处理组（T3B）因颜色异常偏暗而得分较低。部分替代组（T1B, T2B）获得了最佳的总体可接受性评分。
讨论与结论
本研究对现有的关于天然亚硝酸盐替代品的科学文献做出了重要贡献。研究表明，由玫瑰茄花粉末、辣木花粉末和肉桂精油按5.5:4:0.5比例组成的新型植物化学配方，具有优异的抗氧化、广谱抗菌（包括抗梭菌活性）和诱人的比色特性。这种天然防腐剂在变化温度（37 °C, 70 °C, 100 °C）和酸性pH（2, 4, 6）条件下保持了抗菌活性和出色的热稳定性，并在冷藏条件（4 ± 1 °C）下稳定长达30天。此外，该配方在绵羊红细胞的溶血试验和Vero细胞的MTT试验中显示出非细胞毒性，并且对肠道乳酸杆菌无负面影响或影响极小。
将本配方（0.25%, 0.5%, 1%）单独或与化学亚硝酸盐结合添加到鸡肉香肠中以替代亚硝酸盐，在冷藏（4 ± 1 °C）有氧包装储存20天的条件下，改善了处理香肠的品质和货架期。尽管用天然防腐剂完全替代亚硝酸盐能显著改善处理香肠的理化和微生物品质，但由于产生了不典型的深色，感官颜色受到了影响。因此，可以考虑使用天然防腐剂（配方）部分替代亚硝酸钠（1/2至2/3，即75-100 ppm）。
研究结论翻译：本研究对现有的（全球和印度）关于天然亚硝酸盐替代品的有限科学文献做出了重要贡献。研究表明，由玫瑰茄花粉末、辣木花粉末和肉桂精油按5.5:4:0.5比例组成的新型植物化学配方，具有优异的抗氧化、广谱抗菌（包括抗梭菌活性）和诱人的比色特性。这种天然防腐剂在变化温度（37 °C, 70 °C, 100 °C）和酸性pH（2, 4, 6）条件下保持了抗菌活性和出色的热稳定性，并在冷藏（4 ± 1 °C）条件下稳定长达30天。此外，该配方在绵羊红细胞的溶血试验和Vero细胞的MTT试验中显示出非细胞毒性，并且对肠道乳酸杆菌无负面影响或影响极小。将本配方（0.25%, 0.5%, 1%）单独或与化学亚硝酸盐结合添加到鸡肉香肠中以替代亚硝酸盐，在有氧包装冷藏（4 ± 1 °C）储存20天的条件下，改善了处理香肠的品质和货架期。尽管用天然防腐剂完全替代亚硝酸盐能显著改善处理香肠的理化和微生物品质，但由于产生了不典型的深色，感官颜色受到了影响。因此，可以考虑使用天然防腐剂（配方）部分替代亚硝酸钠（1/2至2/3，即75-100 ppm）。此外，本研究强调了未来研究需要探究植物源成分的组合或混合物作为亚硝酸钠和其他合成防腐剂的可持续绿色替代品的协同效应。这种方法有助于开发具有更高品质、安全性和货架期的更健康加工肉制品。未来的努力还应侧重于通过全面的食品安全评估、配方优化和大规模生产试验来验证其功效，以支持工业应用。
