《Polymers》：Hydrogel-Based BMP-2 Delivery for Bone Regeneration: From Material Control to Biological and Translational Evaluation
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骨形态发生蛋白-2（BMP-2）是一种强效的骨诱导因子，但其生物活性快速丧失、局部滞留时间短、突释以及向周围组织扩散等问题降低了剂量效率，并可能因需要超生理剂量而引发局部不良反应。水凝胶作为可调控平台，能够控制BMP-2的定位、暴露和呈递方式。本综述根据主导递
骨形态发生蛋白-2（BMP-2）是一种强效的骨诱导因子，但其生物活性快速丧失、局部滞留时间短、突释以及向周围组织扩散等问题降低了剂量效率，并可能因需要超生理剂量而引发局部不良反应。水凝胶作为可调控平台，能够控制BMP-2的定位、暴露和呈递方式。本综述根据主导递送逻辑将负载BMP-2的水凝胶分为被动空间限制系统、储库单元整合递送系统、刺激响应递送系统和可编程生物交互系统四类，进而评估材料层面的调控能否转化为生物活性保留、细胞响应、骨再生、空间限制性骨形成以及在常规和复杂宿主模型中的临床相关结局。部分系统在化学修饰、固定化或触发释放后能够保留BMP-2活性，并在特定模型中改善骨形成、结构修复或空间定位。然而，延长滞留时间或增加材料复杂性并不总能持续改善修复效果，且真正实现剂量节省的证据仍然有限。修复结局取决于实际生物活性暴露量、材料降解、组织长入、宿主条件及辅助组分。因此，临床转化需要建立特定制剂在剂量、生物活性暴露、修复疗效、局部安全性和可重复生产之间的关联。
论文主体内容总结
1. 引言
大段骨缺损、骨不连以及感染或骨质疏松等不利宿主条件下的骨缺损修复仍是骨科及口腔颌面外科面临的重大临床挑战。骨形态发生蛋白-2（BMP-2）具有明确的骨诱导活性，可促进间充质干细胞（MSCs）的成骨分化。重组人BMP-2（rhBMP-2）以可吸收胶原海绵（ACS）为载体已开发为临床产品并获批用于特定骨修复适应证。临床使用显示了BMP-2促进骨形成的潜力，但也暴露出局部递送控制不足和高剂量相关的副作用。游离BMP-2在体内易降解并被快速清除，ACS主要通过物理吸附负载rhBMP-2，对蛋白释放和局部滞留的控制有限，早期突释明显，临床上常需远超生理水平的剂量以维持局部成骨信号，从而增加异位成骨、软组织肿胀、炎症和骨吸收等风险。水凝胶凭借高度水化的三维网络结构模拟天然细胞外基质（ECM）特征，可通过调节孔径结构、交联密度和降解行为限制BMP-2扩散，并可引入肝素等亲和组分、微球或纳米颗粒储库、刺激响应性连接键以及核酸或细胞介导的局部表达系统，实现对BMP-2负载位置、释放阻力、暴露时长和信号来源的调控。可注射水凝胶还能适应不规则缺损并在原位凝胶化以保留于植入部位。
2. 水凝胶递送BMP-2的策略
2.1 被动空间限制系统
被动空间限制通过连续水凝胶网络的孔径大小、交联密度、溶胀和降解行为调控BMP-2的扩散路径。早期明胶水凝胶研究将BMP-2释放与材料含水量、交联度和降解相关联，聚磷腙体系则显示侧链结构、离子相互作用和聚合物性质可共同调节释放速率。转谷氨酰胺酶交联的聚乙二醇（PEG）水凝胶同时调控刚度、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）含量和可降解交联位点。快速硫醇-烯点击交联PEG水凝胶通过原位网络形成和低溶胀限制rhBMP-2的早期逃逸。丝素基水凝胶可通过凝胶形成方式和复合材料组成调节BMP-2递送，如将聚乳酸（PLA）或聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）掺入PEG-丝素配方可增加疏水性和结构稳定性、减少早期释放并减缓降解。在连续网络中引入亲和位点可进一步增强局部滞留，如肝素化壳聚糖利用肝素对BMP-2的亲和力减少蛋白损失并延缓活性丧失，岩藻依聚糖功能化的脱乙酰β-壳聚糖提供硫酸化多糖结合界面，羧甲基壳聚糖（CMCS）/PEG/硫酸乙酰肝素（HS）水凝胶则将HS结合与基质降解相结合。粘附性表面化学提供另一种局部蛋白固定化途径，如多巴胺处理的含纳米羟基磷灰石和氧化石墨烯的丝素水凝胶可通过粘附界面负载BMP-2。
2.2 储库单元整合递送系统
当BMP-2首先负载于独立工程化的结构单元中，再由水凝胶将这些单元固定于缺损部位时，释放的主要阻力不再仅来自连续水凝胶网络。微颗粒、纳米颗粒、矿化界面、核壳微球或支架孔内的局部水凝胶可提供蛋白结合、降解介导控制和扩散阻力等不同功能，周围水凝胶则作为适形填充物、固定储库单元并提供次级扩散屏障。重组胶原微球研究显示颗粒尺寸和交联影响BMP-2释放。负载BMP-2的明胶微颗粒可分散于生物打印海藻酸盐构建体中，组氨酸标签融合蛋白可通过配位作用定向固定于镍螯合微粒并进一步掺入水凝胶网络。矿化微颗粒通过矿物结合和静电吸附固定BMP-2，壳聚糖（CS）/PEG水凝胶限制颗粒迁移。负载位置的重要性在丝素基复合材料中得到进一步体现：将BMP-2负载于丝素纳米纤维、羟基磷灰石颗粒或两者后再组装水凝胶，可在同一材料平台内获得不同释放曲线。双层甲基丙烯酰化明胶（GelMA）支架中，BMP-2负载的PLGA纳米颗粒掺入高甲基丙烯酰化骨样层，VEGF负载的纳米颗粒置于低甲基丙烯酰化血管样层，两种因子的释放受颗粒降解、凝胶密度和空间位置的共同影响。另一种构型是将BMP-2负载的四臂聚乙二醇-邻苯二甲醛（4armPEG-OPA）/明胶水凝胶填充入3D打印PLGA支架孔隙中，水凝胶约3周降解介导蛋白释放，PLGA支架约5个月降解维持宏观孔隙和结构支撑。核壳结构微球内也可建立扩散屏障，如双层氧化海藻酸钠-羧甲基壳聚糖微球通过静电吸附在内层保留BMP-2，外层多孔聚电解质膜增加扩散阻力。
2.3 刺激响应递送系统
刺激响应水凝胶可通过刺激诱导凝胶化或改变蛋白释放和可及性来调控局部BMP-2递送。温敏mPEG-PLGA共聚物在体温下原位凝胶化，BMP-2随水凝胶降解而释放。基质金属蛋白酶（MMP）敏感PEG水凝胶将rhBMP-2和rhBMP-9共价连接于网络，酶敏感连接和基质降解调节固定化蛋白的暴露。pH响应系统常利用无机颗粒、金属有机框架或动态共价键改变储库稳定性，如聚丙烯酰胺/聚多巴胺/丝素（PDS）水凝胶中，去铁胺（DFO）为早期释放组分，BMP-2包封于CaCO3矿化的沸石咪唑酯框架-90（ZIF-90）中，酸性条件促进矿化层和ZIF-90的序贯分解，形成早期DFO释放与延迟BMP-2释放的时间分离。活性氧（ROS）响应系统常用氧化敏感硼酸酯键改变网络交联或储库暴露，如PVA-TSPBA水凝胶中ROS裂解硼酸酯键促进表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）纳米颗粒早期释放，BMP-2@单宁酸（TA）-ZIF-8在H2O2条件下释放加速。外部能量输入可提供进一步的时间和定量控制，如近红外（NIR）照射通过光热转换增加羟基丁基壳聚糖（HBC）温敏水凝胶中聚多巴胺修饰的Mg-CaCO3微球内BMP-2的累积释放，聚焦超声（fUS）可触发Diels-Alder交联PEG水凝胶的逆Diels-Alder解交联从而增加BMP-2释放。
2.4 可编程生物交互系统
可编程生物交互系统利用编码信息、工程化活体组分或内源性信号捕获在缺损区域内产生和富集BMP-2信号。基因活化基质将BMP2基因多聚复合物掺入聚乳酸（PLA）颗粒并进一步整合入壳聚糖或富血小板血浆（PRP）-纤维蛋白水凝胶中，释放后质粒复合物转染局部细胞驱动缺损内BMP-2表达。富集Bmp2 mRNA的工程化外泌体可通过CP05肽连接子固定于GelMA水凝胶中，BMP-2在mRNA胞内翻译后产生。聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯丙烯酸酯（PEGS-A）水凝胶可携带富集编码BMP-2和VEGF-A mRNA的小细胞外囊泡（EVs）。工程化细胞和活体组分进一步将水凝胶转化为局部BMP-2生产位点，如基因工程表达BMP-2的人骨髓间充质干细胞包封于光交联水凝胶中持续产生BMP-2，一氧化氮（NO）感应工程菌包封于GelMA微球并嵌入甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）水凝胶中，感知局部NO信号后激活BMP-2合成和分泌。材料界面还可捕获组织修复过程中产生的内源性BMP-2，如BMP-2结合肽（BBP）修饰的四面体框架核酸（tFNAs）固定于HAMA水凝胶中富集内源性BMP-2，B2A功能化梯度水凝胶中骨层的纳米羟基磷灰石捕获内源性BMP-2。
3. 生物学评估与临床相关性
3.1 体外生物活性与细胞响应
对于预载BMP-2蛋白的水凝胶，负载量和释放曲线描述蛋白掺入和释放情况，但BMP-2在材料加工后是否保留生物活性需进一步验证。硫醇化rhBMP-2固定于MMP敏感PEG水凝胶后，在SMAD1/5/8报告基因实验中无活性丧失，100和500 nM BMP-2使包封的人MSCs中DNA结合抑制因子1（ID1）表达分别增加190%和620%。聚焦超声触发的Diels-Alder PEG水凝胶释放的BMP-2与等浓度可溶性BMP-2在碱性磷酸酶（ALP）活性和矿化方面无显著差异。低累积释放不一定意味着弱细胞响应，肝素甲基丙烯酰胺微粒28天释放量低于25%，但负载10或30 ng BMP-2的0.1 mg微粒仍能诱导C2C12细胞ALP活性。自组装肽水凝胶在蒸馏水释放实验中12天仅释放约0.4%，但Transwell实验仍能增加下层细胞ALP活性。亲和材料可在不利条件下减缓BMP-2活性丧失，如肝素化壳聚糖在37°C孵育、MMP-9暴露和noggin拮抗条件下保持更高的BMP-2浓度和ALP诱导活性。但过强的结合可能增加滞留同时降低细胞可及性，高亲和力affibody修饰的PEG-Mal水凝胶虽实现更高负载和更低释放，但预复合affibody与BMP-2后降低了C2C12细胞ALP响应。水凝胶递送的BMP-2活性可进一步表现为细胞迁移、成骨分化和基质矿化等下游响应。
3.2 常规模型中骨再生的疗效与空间分布
常规骨修复模型指无感染、骨质疏松、缺血或持续炎症等附加病理条件的骨缺损和融合模型。相同BMP-2剂量下的载体比较可直接揭示完整递送平台对骨修复的影响。含HS的CMCS/PEG水凝胶首日释放约15%的BMP-2，6周时骨体积分数（BV/TV）达52.05%，高于无HS组。羟基磷灰石（HAp）/β-磷酸三钙（β-TCP）微球-水凝胶构建体与胶原海绵各负载10 μg rhBMP-2在大鼠股骨骨不连模型中，6周时骨性愈合率分别为13/17和6/17。剂量-反应关系方面，温敏BOX水凝胶在兔股骨10 mm缺损中递送5、10、20 μg rhBMP-2，12周愈合率分别为2/6、4/6和6/6。在小鼠颅骨4 mm临界尺寸缺损中，0.2 μg BMP-2愈合有限，0.5和1.0 μg接近完全覆盖。大鼠尾椎融合研究中，HAp/β-TCP/水凝胶构建体在3和10 μg剂量下均实现87.5%融合率，而胶原载体分别为50%和62.5%。超分子水凝胶含1.5 μg BMP-2的修复效果接近含15 μg BMP-2的胶原载体。小型猪腰椎融合模型中，500和1000 μg BMP-2均增强椎间融合，但1000 μg未带来额外融合获益，反而在8和16周观察到向椎管延伸的骨赘及局部纤维化和炎症。在大鼠股骨8 mm缺损中，30 μg BMP-2单独递送时4周总新生骨的65.8%位于缺损外，掺入肝素微粒后降至39.4%和44.8%，但12周时骨桥接、矿化密度和扭转负荷无显著差异。快速点击交联PEG水凝胶和胶原载体递送相同1 μg BMP-2均促进颅骨缺损闭合，但胶原组缺损外骨形成更多。丝素水凝胶递送中，两种丝素浓度产生不同体外释放曲线但体内结局无显著差异。矿化微粒复合系统中BMP-2补充在4周显示成骨获益但8周无显著差异。肝素微粒减少BMP-2累积释放约45%并增加早期滞留，但12周时BMP-2单独组5/5骨桥接而微粒组仅3/5。PEG水凝胶研究中网络刚度和MMP介导降解性共同影响骨形成位置和程度。与血管生成信号协调方面，VEGF165/BMP-2联合递送增加新骨形成和血管化，但12周窦底提升高度无显著差异。与炎症和氧化应激调节协调方面，阿司匹林早期释放联合近红外触发BMP-2释放在8周时BV/TV达55.20%，过氧化氢酶（CAT）序贯递送联合BMP-2在8周时BV/TV约70%。
3.3 复杂宿主环境对BMP-2介导骨修复的影响
骨质疏松条件下骨修复取决于新骨形成与持续骨吸收的平衡。去卵巢大鼠5 mm颅骨缺损中BMP-2与EGCG共递送在6周时新骨体积分数达55.1%。老年去卵巢小鼠股骨缺损中，BMP-2单独组骨小梁数量（Tb.N）最高、骨小梁分离度（Tb.Sp）最低，而联合组骨体积分数和骨密度（BMD）更高。糖尿病、牙周炎和种植体周围炎均涉及持续炎症或氧化应激。糖尿病大鼠颅骨缺损中，白细胞介素-10（IL-10）与BMP-2联合递送在8周时实现97.2%骨连接率。牙周炎相关上颌骨缺损中HTF@HA/浓缩生长因子（CGF）水凝胶递送BMP-2在8周增加骨体积分数。细菌诱导种植体周围炎中，GelMA平台联合超声抗菌、二甲双胍和BMP-2递送降低白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平并减少种植体周围骨丢失。活动性感染时，细菌负荷控制直接影响BMP-2诱导的骨修复。金黄色葡萄球菌感染节段性桡骨缺损模型中，PEG-4MAL水凝胶共递送100 ng BMP-2和1 U溶葡萄球菌素（LST）显著增加新骨形成和骨性桥接。未接受LST的感染小鼠即使4周后多数已无法培养出细菌，骨形成仍受损。材料特异性宿主免疫也可改变BMP-2诱导的骨形成。PEG微孔退火颗粒（MAP）水凝胶以相同组成和500 ng BMP-2剂量植入PEG致敏和未致敏小鼠，3周时致敏雄性和雌性小鼠骨体积分别为各自对照的1.71倍和1.44倍，但Masson三色染色显示胶原结构更疏松、排列更紊乱。
3.4 证据层级、临床相关性与推断限度
从体外实验到小动物、大动物乃至人体研究的推进并不自动意味着证据强度逐级增加。评估临床意义需同时回答两个问题：模型是否再现目标适应证的关键条件，以及研究设计在多大程度上允许将观察到的结局归因于递送系统。颅骨缺损模型主要评估新骨形成和缺损内外骨形成的空间分布，节段性长骨缺损还需评估骨性桥接和生物力学性能，脊柱融合模型则确定相邻椎体间能否建立稳定连续性。即使选择了适当模型，阳性结果也不一定允许将效应具体归因于BMP-2递送。BMP特异性信号实验和释放BMP-2与等浓度可溶性BMP-2的比较可直接评估材料加工是否改变BMP-2生物活性，而ALP活性、成骨基因表达和矿化反映的是对完整材料系统的细胞响应。对照设计决定动物研究中可回答的问题：相同BMP-2剂量下不同载体比较可识别递送平台间的疗效差异，同一水凝胶内建立剂量梯度可定义剂量-结局关系，材料单独和单模块对照可区分BMP-2、辅助治疗和水凝胶本身的贡献。人体研究最接近实际治疗，但也最难从整体手术过程中分离水凝胶的独立效应。一项12例患者的随机临床研究中，含或不含BMP-2的透明质酸水凝胶均较阴性对照改善愈合。脊柱融合临床研究中，18例完成12个月随访的脊柱畸形患者全部实现影像学融合，但缺乏同期对照组；254例回顾性比较研究中水凝胶复合组每椎节动态融合率为92.31%，局部自体骨移植组为82.35%，但CT融合率和患者报告功能结局无相应差异。
4. 当前挑战与未来展望
建立材料参数与治疗结局之间的连续关系首先需要准确描述有效BMP-2暴露量。制备过程中添加量、实际负载量、每缺损递送剂量和累积释放分数代表制剂过程的不同阶段，单一参数无法完整描述组织实际遇到的生物活性BMP-2量。含微粒或纳米颗粒的水凝胶中，仅测量内部储库的释放不足以代表完整植入系统的释放行为。预载BMP-2蛋白的系统应记录蛋白来源、制剂输入量、实际负载量、释放量、残留材料相关BMP-2和工艺损失，并通过BMP特异性信号实验或效力实验确认释放BMP-2的功能活性。局部产生的BMP-2应以表达动力学而非质量剂量和释放分数来定义。无论预载还是局部产生，生物活性暴露最终应与新骨形成、骨性桥接、椎间融合和相关生物力学性能相关联，同时评估靶区外骨形成、骨赘形成和邻近组织反应。宿主环境仍可决定信号是否产生稳定新骨。多功能水凝胶应针对特定适应症识别并解决主要修复障碍，而非简单掺入额外组分。抗炎、抗菌、抗氧化、抗吸收或促血管生成模块的必要性应通过BMP-2单独模块、辅助组分单独模块和完整系统的比较来确定。序贯递送应与相同组分同时释放进行比较以确定时间排序是否提供额外修复获益。聚合物基因载体提供结构可调性但需控制细胞相容性和批次一致性，脂质纳米颗粒（LNPs）提供灵活核酸制剂但面临胞内递送和稳定性挑战，腺相关病毒（AAVs）支持持续表达但免疫反应和重复给药是关键限制，EVs携带功能性核酸但货物异质性、纯化和效力标准化使转化复杂化。平台选择需在递送获益与制剂和生产复杂性之间取得平衡。天然材料批次间变异、化学修饰程度、交联密度、BMP-2负载均匀性以及灭菌和储存条件均可影响凝胶化、降解、释放行为和蛋白生物活性。含颗粒复合材料、动态交联系统、刺激响应平台以及核酸或细胞介导系统引入额外质量属性，包括粒径分布、触发阈值、表达持续时间、终止机制和长期生物安全性。这些因素应在开发早期与给药体积、凝胶化时间和植入或注射程序一起定义，并在最终制剂中验证。水凝胶已大幅扩展局部BMP-2递送的设计空间，但尚未广泛消除剂量相关风险或临床应用障碍。
