《Molecules》：Antifungal Efficacy and Chemical Profiles of Salvia, Oregano, and Laurus Essential Oils Against Mold Species Associated with Caciocavallo Cheese Spoilage
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霉菌污染是成熟奶酪腐败的主要原因。本研究从跨越三个季节采样的半硬质Caciocavallo奶酪中回收了171株真菌分离物。回收分离物的数量从夏季到冬季呈描述性下降。经形态型筛选后，选取32株代表菌株进行ITS和/或β-tubulin测序。在这些测序代表菌株中，
霉菌污染是成熟奶酪腐败的主要原因。本研究从跨越三个季节采样的半硬质Caciocavallo奶酪中回收了171株真菌分离物。回收分离物的数量从夏季到冬季呈描述性下降。经形态型筛选后，选取32株代表菌株进行ITS和/或β-tubulin测序。在这些测序代表菌株中，Penicillium commune是最常见的暂定分类学指认（8/32；25.0%），其次是Aspergillus flavus（3/32；9.4%）。Penicillium echinulatum、Fusarium iranicum、Paecilomyces variotii和Cladosporium类分离物各占2/32（6.3%）。在分类学上困难的属中，仅基于ITS的归属被视为暂定最近匹配指认，而非最终物种鉴定。研究人员对三种迷迭香（Salvia rosmarinus Spenn.）化学型（SR-CV2-23、SR-CV3-23和SR-CV6-23）、牛至cv. Carva（Origanum vulgare L. subsp. viridulum (Martrin-Donos) Nyman × O. vulgare L. subsp. hirtum Ietswaart；Ov-C-23）和月桂（Laurus nobilis L.；Ln-23）的精油进行了化学成分表征，并评估了它们对与Caciocavallo奶酪腐败相关霉菌的抗真菌活性。GC-MS分析显示，迷迭香精油富含樟脑、α-蒎烯和1,8-桉叶素；Ov-C-23含有83.95%的香芹酚；Ln-23主要含有1,8-桉叶素、芳樟醇和乙酸龙脑酯。所有精油均表现出浓度依赖性抗真菌活性，孢子萌发通常比菌丝生长更敏感。在0.35%（v/v）浓度下，SR-CV2-23表现出最广的体外抑制活性，而Ov-C-23对A. alternata菌丝生长表现出最高的观察抑制率。CFDA/PI共聚焦显微镜显示，经SR-CV3-23处理后，代谢活性降低和膜损伤的相对变化最大。体外实验和奶酪切片实验使用了不同的定量终点，因此未进行直接比较。在奶酪切片模型中，Ov-C-23对可见菌落数的降低效果最高。这些精油可能有助于综合霉菌控制策略，但实际应用仍需在工业条件下进一步验证。
研究背景与目的：霉菌污染是成熟奶酪腐败的重要原因。Caciocavallo奶酪是一种具有重要工艺和商业价值的传统意大利pasta filata（拉伸凝乳）奶酪，在成熟和储存期间表面易被丝状真菌定植，导致感官品质下降、货架期缩短，并可能存在真菌毒素风险。清洁标签食品需求推动了对植物精油（essential oil, EO）作为天然抗菌剂的关注，但EO活性高度依赖其化学成分，且奶酪基质中的蛋白质和脂质可结合或分配疏水性成分，降低其自由有效浓度。目前，针对来自Caciocavallo奶酪的野生霉菌及在该特定脂蛋白基质中评估迷迭香、牛至和月桂EO活性的数据仍有限。因此，本研究旨在描述三个采样季节中Caciocavallo奶酪可培养真菌种群，通过GC-MS表征五种EO，并在体外和人工接种奶酪切片模型中评估其对奶酪相关霉菌的抗真菌活性。
主要技术方法：样本来自意大利Gioia del Colle的Capurso Azienda Casearia S.r.l.提供的同一来源Caciocavallo奶酪，于夏季、秋季和冬季各采集3个独立生物学样本。研究人员采用形态学分组和分子测序（ITS和/或β-tubulin基因）鉴定代表菌株；用GC-MS分析精油化学成分；比较奶酪琼脂培养基（CAM）与马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上的菌丝生长；以接触法测定EO对8种霉菌的菌丝生长抑制和孢子萌发抑制；用CFDA/PI双染共聚焦显微镜评估P. commune孢子活力；在人工接种P. commune的奶酪切片上评价可见菌落减少；并进行非摄食性嗅觉初步感官评价。统计分析采用双因素ANOVA及Sidak或Tukey校正。
研究结果：
2.1 分离真菌属的季节分布：共回收171株可培养真菌分离物，夏季70株、秋季61株、冬季40株，呈描述性下降趋势。夏季和秋季Penicillium属最频繁，冬季Fusarium属最频繁。总体而言，Penicillium属占比最大，其次为Fusarium、Paecilomyces、Aspergillus、Alternaria、Cladosporium和Microascus。该季节模式基于合并分离物计数，属描述性趋势而非统计差异。
2.2 代表真菌分离物的分子鉴定与分类多样性：对32株代表菌株进行ITS和/或β-tubulin测序后，Penicillium commune最常见（8/32，25.0%），其次为Aspergillus flavus（3/32，9.4%）；Penicillium echinulatum、Fusarium iranicum、Paecilomyces variotii和Cladosporium类分离物各占2/32（6.3%）。另有单株对应P. polonicum、P. brevicompactum、A. alternata等。Cladosporium类和Microascus类因序列相似性不足未赋予种级名称。在分类学困难属中，仅基于ITS的归类被视为暂定最近匹配指认。
2.3 CAM与PDA上菌丝生长比较：双因素ANOVA显示“分离株×培养基”交互作用显著。Sidak校正后，所有Penicillium分离株在CAM和PDA上的生长无显著差异；F. iranicum、F. tricinctum和F. avenaceum在PDA上显著优于CAM。总体来看，CAM在14±2°C下能支持多种奶酪相关霉菌生长，可提高EO筛选与奶酪基质的相关性。
2.4 精油化学成分：三种迷迭香精油（SR-CV2-23、SR-CV3-23、SR-CV6-23）均以樟脑、α-蒎烯和1,8-桉叶素为主要成分，但相对比例不同。Ov-C-23以香芹酚为主（83.95%），Ln-23以1,8-桉叶素、芳樟醇和乙酸龙脑酯为主。精油得率以SR-CV2-23最高（3.33%），Ln-23最低（1.08%）。
2.5 精油对野生霉菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用：所有EO均表现出浓度依赖性抗真菌活性。0.35%（v/v）时，SR-CV2-23对P. camemberti、P. commune、A. alternata、A. tenuissima和F. tricinctum的菌丝抑制较高；Ov-C-23对A. alternata菌丝生长抑制最高（58.5±4.4%）。孢子萌发抑制普遍高于菌丝生长抑制；A. montevidensis、A. flavus、A. alternata和P. commune总体较敏感，Fusarium spp.敏感性较低。这些最大值为观察数值，未经统计推断不支持时不做差异解释。
2.6 EO处理对代表野生菌株P. commune孢子活力的影响：CFDA/PI共聚焦显微镜显示，未经处理的孢子呈现较强绿色荧光和较弱红色荧光，表明代谢活跃且膜完整。经0.35%（v/v）EO处理后，孢子绿色荧光降低、红色荧光增加，表明代谢活性下降和膜完整性受损。其中SR-CV3-23处理后红色荧光增强较为明显，Ov-C-23也呈现明显膜损伤信号；该观察为定性比较证据。
2.7 精油在人工污染奶酪表面抑制真菌生长和产孢：在人工接种P. commune的奶酪切片上培养14天后，EO处理组可见菌落数较乳化剂对照减少，且呈浓度和精油种类依赖性。0.35% Ov-C-23使可见菌落减少97.2%，0.25%时减少93.4%；SR-CV2-23在相应浓度下减少92.3%和84.5%；SR-CV3-23和SR-CV6-23居中，Ln-23较低。该结果仅表示可见菌落数减少，不能解释为真菌被完全杀灭或活力丧失。
2.8 初步非摄食感官评价：经16名未受训成人评定，低浓度EO处理样品获得较高喜好度评分。迷迭香化学型中，SR-CV3-23和SR-CV6-23在低浓度下气味评分较佳，SR-CV2-23在0.25%（v/v）时评分最高；Ov-C-23和Ln-23的气味评分随浓度波动。该结果仅作为相对气味可接受性的初步指标。
讨论总结与结论翻译：讨论指出，Caciocavallo奶酪表面真菌群落多样，Penicillium占优势与已有研究一致；季节变化为描述性趋势，可能受环境因素影响。EO活性应结合化学组成解释，三种迷迭香精油成分差异可能影响其抗真菌谱，Ov-C-23富含香芹酚可能与其活性相关，但未测试纯品或重组混合物。Ln-23尚有15.75%未鉴定成分。体外实验与奶酪切片实验因终点不同不能直接比较；可见菌落减少不能等同于产毒减少，因本研究未测定霉菌毒素。EO对乳酸菌的影响和法规审批也需进一步考虑。CFDA/PI实验仅提供定性证据。结论翻译如下：本研究描述了Caciocavallo奶酪可培养真菌种群的季节模式，冬季分离物少于夏季，优势类群由夏秋的Penicillium转变为冬季的Fusarium；由于基于合并分离物计数，该模式为描述性。所测精油引起菌丝生长、孢子萌发、相对活力信号和可见菌落形成的浓度依赖性降低。其中SR-CV2-23表现出较广的体外活性，Ov-C-23在奶酪切片模型中产生最高的可见菌落减少。但未实现完全杀灭，且活性取决于精油组成、剂量、真菌种类和奶酪基质。缺乏MIC/MFC或EC50测定、商业阳性对照、工业成熟验证、直接霉菌毒素测量和正式消费者感官研究，限制了实际解释。EO策略应作为栅栏技术的组成部分而非独立防腐剂进行评估，并需结合适当设计的感官研究判断其实用可接受性。
