《iScience》：The misplaced mouse Pax6 interneuron subclass: A cross-species transcriptomic reassignment
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亚类细胞类型在哺乳动物大脑中高度保守，这使得小鼠转录组图谱中尾侧神经节隆起（caudal ganglionic eminence, CGE）Pax6中间神经元亚类的系统性缺失显得出乎意料。通过跨物种转录组分析，研究人员在小鼠中鉴定出一个Pax6亚类同源物，并揭
亚类细胞类型在哺乳动物大脑中高度保守，这使得小鼠转录组图谱中尾侧神经节隆起（caudal ganglionic eminence, CGE）Pax6中间神经元亚类的系统性缺失显得出乎意料。通过跨物种转录组分析，研究人员在小鼠中鉴定出一个Pax6亚类同源物，并揭示了Sncg亚类中的灵长类特异性分化。对电生理和空间数据集的分析显示，这两种模态中的亚类特异性结构均有限，强调了转录组学在亚类区分中的卓越解析能力。研究结果凸显了在细胞类型注释中依赖小规模标记基因集的陷阱，并提供了具有进化意识的注释和标记集，以支持稳健的跨哺乳动物中间神经元比较。
PAX6是发育生物学中重要的转录因子，在神经发育中广泛表达。成年灵长类单细胞图谱中注释了一个尾侧神经节隆起（caudal ganglionic eminence, CGE）来源的中间神经元亚类，命名为Pax6亚类，但小鼠转录组图谱中却始终缺乏该亚类注释，这构成跨物种细胞类型注释的重要不一致。由于亚类级身份通常跨平台、数据集和物种稳定，该缺失既可能反映灵长类特化，也可能反映小鼠中同源类群的错位。研究人员对小鼠和灵长类（人、黑猩猩、大猩猩、猕猴、狨猴）的CGE和内侧神经节隆起（medial ganglionic eminence, MGE）中间神经元进行了跨物种转录组荟萃分析，以解决该问题。结果发现小鼠中存在Pax6亚类的转录组同源物，而Sncg亚类可能为灵长类特化，并给出了进化感知的注释和标记集。
研究人员整合了来自Allen研究所（小鼠及跨灵长类内侧颞叶回）、Broad研究所（小鼠全脑）、Yale（灵长类背外侧前额叶）、UT Southwestern（灵长类后扣带回）等公开数据集，并纳入树鼩、大鼠皮层数据集。使用MetaNeighbor通过细胞间基因表达相似性鉴定跨数据集可重复的细胞簇；使用MetaMarkers计算差异表达统计并生成多基因标记集；采用one-vs-best MetaNeighbor将小鼠簇映射至灵长类亚类。电生理分析利用了Gouwens等人2020年的小鼠Patch-seq数据，空间分析利用了Allen研究所的MERFISH全脑图谱。所有数据均经CPM标准化并限定为1:1直系同源基因。
标记物聚合增强跨物种差异表达信号：通过比较各亚类同名标记基因的差异表达，发现SNCG在灵长类中呈现MGE来源阳性表达，而非预期的CGE来源，表明标记基因存在跨物种漂移。PAX6在小鼠Sncg亚类中检测到轻度正差异表达，提示Pax6亚类可能被错误注释。使用递增数量的标记物集合进行富集分析，发现聚合标记集能可靠恢复预期趋势，而单个标记表现不稳定。
小鼠中存在转录组Pax6亚类同源物：通过one-vs-best MetaNeighbor分析，研究人员将多个小鼠数据集中的可重复簇与九种灵长类亚类（包括Pax6）进行映射，发现所有小鼠簇都能找到稳健的1:1最佳匹配。原始注释为Sncg的簇以及部分Lamp5和Vip簇被重新映射至灵长类Pax6亚类；而最接近灵长类Sncg的小鼠簇多为原始Vip簇。表达分析显示，小鼠PAX6表达主要集中在重新映射至Pax6的Lamp5细胞，而小鼠Sncg标记富集于Sncg至Pax6的簇，表明原始注释将同源Pax6群体分散在不同亚类中。
跨物种标记基因特征：研究人员计算了同源亚类标记基因的Pareto前沿，以同时优化信噪比和覆盖度。FREM1是小鼠Pax6同源亚类的高性能标记，SORCS3、MAML3和CDH24在灵长类和跨哺乳动物中均为Pax6亚类标记。CXCL14是Sncg亚类的最佳跨物种标记，但其在Pax6亚类中也具有强差异表达，提示缺乏Sncg特异性保守标记。
同源小鼠中间神经元亚类的电生理变异性：使用176个离子通道相关基因进行转录组降维，同源CGE亚类仍可分离。与原注释相比，同源标签解释的电生理方差略有增加，但远小于其对转录组方差的解释。基于电生理特征的细胞间相似性主要沿Vip-Lamp5轴分布，无法清晰区分Pax6、Sncg等CGE亚类。
亚类特异性电生理特征：通过将Pax6细胞与非Pax6 CGE细胞比较，发现Pax6细胞具有较低的基强度动作电位宽度和基强度上升/下降比，表明放电稍快。基强度上升/下降比也是Pax6细胞与MGE细胞之间的唯一显著差异。
同源小鼠中间神经元亚类的空间变异性：利用MERFISH全脑图谱分析细胞邻域组成和皮层分层，发现空间组成主要反映MGE深层、CGE浅层的偏好，而非亚类特异性。大多数亚类同时包含皮层和海马簇，包括Pax6和Sncg同源类群。
Sncg中间神经元亚类的灵长类特异性分化：在两个独立的灵长类数据集（Yale和UT Southwestern）中，Sncg亚类在灵长类内部高度可重复，但在小鼠、大鼠和树鼩中，其最佳同源匹配均为Vip出去群，表明该亚类可能为灵长类谱系特异性创新。直系同源/旁系同源标记分析显示，人类Vip出去群在非灵长类中表达更多Sncg直系同源物，支持其与祖先Vip谱系的重塑关系。
总结讨论：研究人员强调，细胞身份分布于整个转录组，单一或小规模标记基因集在跨物种比较中易失去可靠性。因此，转录组可重复性应作为识别转录组细胞类型的首要基准，即跨技术、数据集、脑区和物种的可重复性。只有当转录组群体在进化上保守时，才能作为可靠生物学单元。转录组分类学是当前最佳近似，未来蛋白质组学可能提供更强基准。结论部分，该研究重新定位了小鼠中被错误放置的Pax6中间神经元亚类，证明其在小鼠中具有转录组同源物，同时揭示Sncg亚类可能是灵长类特化，并提供进化感知的注释和标记集，以支持跨哺乳动物中间神经元比较。
