《Membranes》：Rapid Screening and Analysis of Putative Bioactive Candidates in Zhizhu Decoction Using Membrane-Based Affinity Ultrafiltration-Mass Spectrometry
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枳术汤（ZZD）作为经典传统中药复方，长期以来一直被用作肥胖症的有效治疗方法。然而，由于其化学成分复杂且缺乏基于靶标的筛选策略，对其潜在生物活性成分及其作用机制的快速分析仍是一项具有挑战性的任务。本研究建立了一种基于超滤膜的超滤膜生物亲和超滤-质谱（AUF-M
枳术汤（ZZD）作为经典传统中药复方，长期以来一直被用作肥胖症的有效治疗方法。然而，由于其化学成分复杂且缺乏基于靶标的筛选策略，对其潜在生物活性成分及其作用机制的快速分析仍是一项具有挑战性的任务。本研究建立了一种基于超滤膜的超滤膜生物亲和超滤-质谱（AUF-MS）快速筛选系统，联合脂肪酶和α-葡萄糖苷酶进行靶向筛选。以再生纤维素膜材料制成的超滤离心管作为核心分离单元：将酶与ZZD孵育后，超滤膜在靶酶存在下优先保留化合物，而通过多级缓冲液离心和洗涤去除未结合的游离小分子。随后，洗脱在靶酶存在下显示优先保留的化合物，并使用超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）进行进一步表征。候选生物活性化合物在游离脂肪酸（FFA）诱导的脂质沉积细胞模型中进一步评估。研究人员在ZZD提取物中检测到39种化合物，通过超滤膜筛选系统，成功推定鉴别出至少12种在脂肪酶存在下显示优先保留的化合物。值得注意的是，柚皮苷、橙皮苷和枳属苷在基于脂肪酶的AUF-MS筛选中显示出优先保留，并在游离脂肪酸（FFA）诱导的脂质沉积细胞模型中进一步评估了它们潜在的细胞脂质调节作用，在测试条件下，这三种化合物均与脂质积累和甘油三酯含量降低相关。特别是柚皮苷和橙皮苷在相对较低浓度下显示出显著效果，突显了它们作为有前景的生物活性化合物供进一步研究的潜力。该研究使用基于膜的AUF-MS筛选策略鉴定出ZZD中若干推定酶相互作用候选物，并进一步在FFA诱导的HepG2细胞模型中评估了所选化合物的潜在脂质调节作用。更重要的是，它证明了将该筛选策略应用于初步候选物鉴定的可行性。
一、研究背景与现有问题
全球范围内脂质代谢紊乱及相关疾病患病率急剧上升，给公共卫生带来沉重负担。代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）全球患病率为30%–40%，在2型糖尿病和肥胖人群中分别占60%–70%和70%–80%。肥胖及相关代谢紊乱已成为重大全球健康挑战。部分西药虽能控制血糖血脂，但常伴随肝损伤、急性肾损伤和胰岛素抵抗等副作用，长期疗效有限。中药复方枳术汤（ZZD）源自《金匮要略》，由枳实和白术组成，传统上用于治疗腹胀、腹满和消化不良，现代应用已扩展到糖脂代谢相关疾病。药理实验显示，枳术颗粒可降低模型大鼠总胆固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和葡萄糖（GLU）水平，并改善肝脏脂肪变性。单味药枳实对乙酰氨基酚诱导的肝坏死具有保护作用，白术可通过改善高密度脂蛋白胆固醇功能促进胆固醇逆向转运。然而，ZZD的具体药效物质基础仍不明确。
高效筛选中药复杂体系中的活性成分是中药现代化的关键步骤。传统植物化学筛选方法依赖顺序提取、分级、纯化和活性测试，费时费力且易忽略弱活性成分。现有生物亲和筛选技术如表面等离子共振（SPR）和亲和色谱（AC）需要复杂靶标固定，可能导致蛋白构象变化和空间位阻，并受基质干扰。生物亲和超滤（AUF）方法基于靶标-配体相互作用，利用半透性超滤膜筛选潜在配体，无需固定靶标，具有独特优势。本研究旨在建立一种多靶标亲和超滤-质谱（AUF-MS）方法，以α-葡萄糖苷酶和脂肪酶为靶酶，快速筛选ZZD中潜在生物活性成分，并通过细胞模型验证其潜在糖脂调节作用。
二、研究内容与主要结论
研究人员开发了基于再生纤维素膜超滤离心管的AUF-MS筛选系统，将ZZD提取物与α-葡萄糖苷酶和脂肪酶孵育后，利用不同截留分子量（MWCO）的超滤膜选择性地保留靶酶-配体复合物，洗脱后用UPLC-Q-TOF-MS/MS进行结构鉴定。在ZZD提取物中共检测到39种化合物；通过超滤膜筛选，至少12种化合物在脂肪酶存在下显示优先保留。其中柚皮苷、橙皮苷和枳属苷在脂肪酶筛选中显示较高结合度（BD），并在游离脂肪酸（FFA）诱导的HepG2脂质沉积模型中进一步验证。结果表明，三种化合物均与脂质积累和TG含量降低相关，柚皮苷和橙皮苷在相对较低浓度下效果显著。该研究证明了膜基AUF-MS筛选策略在中药候选物初步鉴定中的可行性。
三、主要关键技术方法
ZZD水提物由枳实（60.0 g）和白术（30.0 g）加水煎煮制备，药材分别购自湖南和安徽，经中国科学院宁波材料技术与工程研究所郭明全教授鉴定。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS在正负离子模式下对ZZD提取物进行化学成分分析。亲和超滤筛选中，ZZD样本分别与α-葡萄糖苷酶（2 U，分子量约67–70 kDa）和脂肪酶（2 mg/mL，分子量约50–52 kDa）于37°C孵育40分钟；使用不同MWCO的超滤离心管（α-葡萄糖苷酶用30 kDa，脂肪酶用10 kDa）离心去除未结合小分子，甲醇洗脱保留物后进行质谱鉴定，并按公式计算BD值。细胞实验中，HepG2细胞（来自中国科学院典型培养物保藏委员会，第12–15代）用FFA（油酸与棕榈酸摩尔比2:1）诱导脂质沉积，采用CCK-8、油红O染色和生化试剂盒检测细胞活力、脂质积累及葡萄糖和TG含量。
四、研究结果
4.1 枳术汤对HepG2细胞脂质代谢的初步影响
CCK-8实验显示，ZZD在1000 μg/mL浓度内维持高细胞活力，因此选择500、250、125 μg/mL进行后续实验。阳性对照参芪降糖颗粒显著降低Glu、TG和T-CHO水平；ZZD在500 μg/mL时也显著降低这三项指标，250 μg/mL时仅显著降低Glu，125 μg/mL时无显著影响。这表明ZZD对HepG2细胞糖脂代谢具有剂量依赖性调节作用，且不同代谢指标对浓度的响应存在差异。
4.2 枳术汤化学成分注释
采用UPLC-Q-TOF-MS/MS负离子模式推定鉴定出25种化合物，主要为有机酸和黄酮类；正离子模式检出17种化合物，主要为黄酮、柠檬苦素和生物碱。两种电离模式结果互补，提高了化合物鉴定的覆盖率和可靠性。例如，忍冬苷和枳属苷在正负离子模式下均被检出，其前体离子和特征MS/MS碎片一致。
4.3 亲和超滤筛选潜在的α-葡萄糖苷酶和脂肪酶相互作用成分
基于AUF-MS筛查，在脂肪酶存在下，负离子模式中柚皮苷（BD 49.69%）、橙皮苷（48.52%）、nomilinic acid 17-O-β-D-葡萄糖苷（54.31%）、枳属苷（62.20%）、木犀草素（23.99%）、橙皮素（51.98%）和绿原酸衍生物（约59.49%）等显示出较高BD值；正离子模式中gardenin B（48.81%）、artemetin（约56%）、橘皮素（35.94%）、川陈皮素（约49%）和异橙黄酮（约30%）等也有较高BD值。至少12个成分在脂肪酶存在下表现出较高BD值。对α-葡萄糖苷酶，负离子模式中柚皮苷、橙皮苷和枳属苷BD值分别为19.49%、19.85%和23.80%；正离子模式中水苏碱和gardenin B BD值较低。所有α-葡萄糖苷酶BD值均低于30%。柚皮苷、橙皮苷和枳属苷在两种靶酶筛选中均显示出可检测的保留，提示值得进一步研究。
4.4 柚皮苷、橙皮苷和枳属苷对FFA诱导脂质积累的细胞效应
在HepG2细胞中，柚皮苷对细胞活力无显著影响，橙皮苷和枳属苷则浓度依赖性降低细胞活力。FFA成功诱导脂质沉积。柚皮苷在所有测试浓度（125–500 μg/mL）下显著降低脂质沉积，500和250 μg/mL时显著降低TG含量，但对葡萄糖水平无显著影响。橙皮苷在12.5、25、50 μg/mL时显著降低脂质积累和TG含量，葡萄糖水平虽降低但未达统计学显著。枳属苷在2.5–10 μg/mL浓度依赖性地降低脂质沉积和TG含量，但高浓度时细胞活力明显下降，因此不能完全排除细胞代谢活性改变对脂质减少的贡献。
五、讨论总结与结论
讨论指出，ZZD对不同代谢指标的效应存在剂量差异，反映其成分复杂性和可能的多通路调节。α-葡萄糖苷酶和脂肪酶在糖脂代谢中发挥重要作用，同时作为靶酶可筛选潜在的降糖和降脂化合物。然而，AUF-MS中化合物在靶酶存在下的优先保留并不等同于直接的酶抑制机制，后续FFA诱导的HepG2模型提供了细胞水平的互补证据。柚皮苷、橙皮苷和枳属苷是柑橘类中药中常见的黄酮类成分，已有文献报道其具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等活性。本研究为这些化合物的脂质调节作用提供了新的初步证据，其中橙皮苷在有效性和有效浓度范围间表现出较好的平衡，可能更适合作为候选功能成分。研究局限性包括AUF实验为单次测量、未设置膜相关对照，BD值为初步结果；也未独立评估膜-分析物相互作用和膜污染；细胞活力在完全培养基而非FFA条件下评估，对枳属苷的脂质降低结果需谨慎解读。
研究结论：本研究建立了基于膜的AUF-MS方法，利用超滤膜的选择性保留特性富集与靶酶α-葡萄糖苷酶和脂肪酶优先相互作用的成分，并结合UPLC-Q-TOF-MS/MS进行鉴定。筛选结果显示，ZZD中存在多个对脂肪酶具有较高BD值的候选化合物，其中柚皮苷、橙皮苷和枳属苷的BD值相对较高；柚皮苷和枳属苷对α-葡萄糖苷酶也具有可检测的BD值。进一步体外验证显示，柚皮苷和橙皮苷在有效浓度范围内具有脂质调节活性，枳属苷在测试条件下与HepG2细胞脂质积累减少相关，但不能完全排除细胞活性改变的影响。该多靶标AUF-MS方法可用于ZZD候选物的初步筛选，也可能适用于其他天然药物中潜在活性成分的筛选。总体而言，柚皮苷和橙皮苷可作为进一步研究其脂质调节活性的候选化合物。
