睡眠限制调节真菌感染后的B-1细胞应答

《Immunobiology》：Sleep restriction modulates B-1 cell response following fungal infection

　　

睡眠限制调节真菌感染后的B-1细胞应答。睡眠限制调节腹膜B-1细胞对真菌感染的应答；来自睡眠限制小鼠的B-1细胞表现出增加的一氧化氮（NO）产生；睡眠限制增强B-1细胞中Toll样受体2（TLR2）和白细胞介素-12（IL-12）的表达；谱系定向分析显示，睡眠限制后B-1细胞发生髓系极化，且与真菌种类（白色念珠菌C. albicans或巴西副球孢子菌P. brasiliensis）无关。

B-1细胞是主要存在于腹膜腔、胸膜腔和脾脏中的独特B淋巴细胞亚群，以产生天然抗体和调节炎症著称，并具有分化为B-1细胞衍生吞噬细胞（B-1 CDP）的能力，可吞噬病原体、产生一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）并呈递抗原。睡眠对免疫系统有重要调节作用；睡眠限制可损害生发中心发育并降低抗原特异性抗体滴度。研究人员前期工作显示，21天睡眠限制可促使腹膜B-1细胞向B-1 CDP分化，通过增加NO和ROS产生增强杀菌能力，同时伴随淋巴定向因子表达的有害调节，提示睡眠限制诱导B-1细胞呈现髓系表型。然而，该效应是否具有普遍性，或是否取决于抗原或病原体类型，尚不清楚。为此，研究人员选用白色念珠菌（Candida albicans）和巴西副球孢子菌（Paracoccidioides brasiliensis）两种真菌模型，评估睡眠限制小鼠B-1细胞对真菌感染的先天应答。研究人员发现，睡眠限制显著改变B-1细胞的生理状态，使其向髓系表型偏移，且这种偏移与真菌种类无关；这为理解睡眠限制如何影响先天免疫及B-1细胞功能提供了新证据，也强调了睡眠质量对免疫稳态的重要性。

研究人员使用雄性C57BL/6J小鼠（8–10周龄，购自巴西圣保罗联邦大学实验模型开发中心CEDEME；每组6只，每项分析至少独立重复2次），采用多平台法建立每日18小时、持续21天的睡眠限制模型。第20天经腹腔感染P. brasiliensis Pb18株（1×10⁶细胞/只）或C. albicans ATCC 40006株（1×10⁵细胞/只），感染24小时并继续睡眠限制后处死动物。通过流式细胞术鉴定CD23^-CD19⁺ B-1细胞，检测CD80、CD86、CD40、MHC-II、NO和ROS；用CD23阴性/CD19阳性磁珠分选纯化B-1细胞，以定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测TLR2、TLR6、TLR9，细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12，以及髓系定向因子G-csfr、M-csfr、Spi1和淋巴定向因子EBF、E2A、IL-7R的基因表达，并以2^-ΔΔCt法进行相对定量。血清皮质酮用放射免疫法检测。

3.1 睡眠限制小鼠经P. brasiliensis或C. albicans腹腔刺激后B-1细胞共刺激分子与杀菌分子分析
流式细胞术结果显示，P. brasiliensis感染后，睡眠限制组B-1细胞CD80和CD86表达较对照组无显著变化；C. albicans感染后，CD80表达无变化，但CD86的平均荧光强度（MFI）显著降低；CD40和MHC-II均无显著改变。NO产生在两种真菌感染的睡眠限制组B-1细胞中均显著升高，而ROS产生在两组真菌模型下均无显著变化。这表明睡眠限制以不依赖真菌种类的方式增强B-1细胞NO产生。

3.2 睡眠限制对腹腔B-1细胞TLR和细胞因子基因表达的影响
qRT-PCR检测显示，睡眠限制小鼠感染P. brasiliensis或C. albicans后，B-1细胞TLR2表达均显著升高（分别为P<0.001和P<0.01），TLR6和TLR9表达无变化。细胞因子方面，P. brasiliensis感染组TNF-α、IL-6、IL-10表达无显著变化，但IL-12表达显著升高（P<0.0001）；C. albicans感染组TNF-α和IL-6表达显著升高，IL-10无变化，IL-12同样显著升高。这表明睡眠限制增强TLR2和IL-12表达具有跨真菌种类的普遍性，而部分炎症细胞因子的变化依赖真菌种类。

3.3 睡眠限制小鼠B-1细胞淋巴/髓系定向基因表达分析
谱系定向基因分析显示，与对照组相比，睡眠限制小鼠感染P. brasiliensis或C. albicans后，B-1细胞中髓系定向因子G-csfr、M-csfr和Spi1表达均显著增加；淋巴定向因子EBF和E2A表达无变化，仅C. albicans感染组IL-7R表达显著升高。这提示睡眠限制独立于真菌种类诱导B-1细胞向髓系极化。

讨论中，研究人员指出，睡眠限制后B-1细胞NO产生持续增加，与病原体刺激无关；NO产生受睡眠影响且具有细胞类型依赖性。TLR2在睡眠限制B-1细胞中升高，而TLR2持续表达与慢性炎症状态相关，提示B-1细胞获得更偏向炎症的表型。B-1细胞通常天然产生抗炎细胞因子IL-10，但睡眠限制后开始表达TLR2、IL-12等炎症相关标记物，说明睡眠限制与免疫系统的相互作用较为复杂。髓系极化与B-1细胞向吞噬细胞表型分化一致。血清皮质酮水平在睡眠限制组和对照组感染动物间无显著差异，提示应激不是主要影响因素，慢性睡眠限制本身与观察到的B-1细胞表型变化相关。研究人员总结道：睡眠限制显著改变B-1细胞的生理状态，使其向髓系表型偏移，且这种偏移与所给予的微生物种类无关；但用于刺激B-1细胞急性应答的感染模型也影响观察到的细胞应答。该研究数据为B-1细胞行为提供了有价值的见解，并强调在睡眠限制背景下研究免疫变化的重要性。B-1淋巴细胞的这些变化可能直接影响免疫应答质量和稳态维持能力，凸显维持睡眠质量的意义。