将分子模拟与苦味受体建模相结合，揭示了核桃蛋白酶水解产物的苦味机制

《Food Chemistry》：Combining molecular simulations and bitter receptor modelling reveals the bitter-taste mechanism of walnut protease hydrolysates

　　

• •
  通过计算机辅助的肽组学方法结合细胞测定，从核桃蛋白水解物中鉴定出了苦味肽
• •
  T2R1、T2R14和T2R41被确定为被激活的候选受体。
• •
  分子对接和动力学模拟揭示了苦味肽与受体之间的相互作用。
• •
  共表达T2R的细胞在核桃蛋白水解物以及LHFR、KIV10和LIG9肽的作用下表现出Ca²⁺流的变化。
• •
  KIV10在T2R14过表达细胞中调节苦味信号传导和Ca²⁺通路。

引言

核桃（Juglans regia L）是一种全球重要的坚果，也是植物蛋白的主要来源。它广泛种植于东亚、北美和东南欧（Yan & Zhou, 2021）。与大豆和花生蛋白相比，核桃蛋白具有更平衡的氨基酸组成和更高水平的限制性氨基酸，这赋予了它“优质蛋白”的营养特性（Wen et al., 2023）。通过酶促水解将核桃蛋白分解成肽可以提高其关键加工性能，如溶解性、乳化和起泡性（Feng et al., 2024; Wang et al., 2021），同时赋予其多种生理活性，如抗氧化（Hu et al., 2023）、抗高血压（Xie, Chen, et al., 2024）和抗炎作用（Xia et al., 2024）。这一过程对于提高核桃的附加价值并扩展其在食品工业中的应用至关重要。然而，水解过程也带来了一个重大挑战：疏水性氨基酸的大量释放可能导致苦味肽的形成（Ying et al., 2021）。这些苦味肽会与T2R（2型味觉受体）家族结合，引发味觉信号转导并通过神经通路产生特定的味觉感受。强烈的苦味会显著影响产品的接受度，成为制约高价值核桃肽产品开发的技术瓶颈。

核桃蛋白水解物（WPHs）中的苦味主要源于其独特的氨基酸组成，特别是富含谷氨酰胺和疏水性残基（Wang, Tao, et al., 2024）。酶促切割暴露了这些隐藏的疏水性末端，生成了作为T2R特异性配体的短肽。因此，WPHs特别容易产生强烈的苦味，形成了其商业价值化的特定技术障碍。为了克服这一障碍，阐明衍生苦味肽与其相应受体之间的分子水平相互作用至关重要。

通常，苦味的感知是一个多方面的生理过程，主要由苦味受体介导。这些受体由T2R基因家族编码，是机体检测苦味能力的分子基础（Chu et al., 2024）。作为G蛋白偶联受体（GPCRs）家族的一员，这些受体具有GPCRs典型的结构特征，包括七个跨膜α螺旋结构域、三个细胞外环和三个细胞内环。N端位于细胞外，C端位于细胞内。迄今为止，人类已鉴定出25种苦味受体，主要表达在舌头和腭部的特定味觉受体细胞中（Ahmad & Dalziel, 2020）。GPCRs的信号转导依赖于异三聚体G蛋白，由α、β和γ三个亚基组成。β和γ亚基通过非共价相互作用形成紧密结合的βγ二聚体。在苦味信号转导过程中，激活的α-gustducin亚基刺激磷酸二酯酶，催化环腺苷单磷酸（cAMP）的分解，导致其浓度下降。这种下降减轻了环核苷酸对通道的抑制作用，使细胞膜上的Ca²⁺通道打开，从而诱导钙离子从细胞外空间流入（Rosenzweig et al., 1999）。同时，βγ亚基从α-gustducin中解离并激活磷脂酶Cβ2（PLCβ2）。这种酶催化生成肌醇三磷酸（IP?），促使内质网释放额外的Ca²⁺。这两条途径共同导致细胞内Ca²⁺浓度显著升高。因此，细胞内Ca²⁺浓度的变化是苦味受体激活状态的可靠指标。苦味物质刺激苦味受体，激活细胞内信号通路，导致细胞膜去极化。这一过程在神经细胞的突触后区域引发兴奋，通过各种神经传递到孤束核。在该区域，中枢神经系统识别到这一信号，形成苦味感知（Gilbertson et al., 2000）。

目前关于食品蛋白衍生物肽的苦味机制的研究有限，大多数研究集中在动物蛋白上，如牛奶和肉类蛋白。对水解植物蛋白产品的系统分析，尤其是来自核桃的产品，仍然很少。Maes等人（2025）在研究牛奶蛋白时，通过肽组学和细胞实验发现不同乳酸菌发酵产生的多肽混合物与苦味强度之间存在显著相关性。然而，这些方法往往难以阐明分子机制，筛选效率也有限。尽管Dai等人（2024）使用分子对接和转录组分析来确定火腿苦味肽与其受体的结合方式，但他们的筛选方法基于传统的肽分离策略，不太适用于复杂的植物肽库。因此，本研究专注于核桃的蛋白水解产物。利用整合的肽组学和细胞验证框架，通过BitterX工具预测苦味肽，有效地从复杂的核桃肽库中识别出高潜力的苦味肽，并确定主要候选受体。随后，我们使用分子对接为预测的肽段分配结合能分数，优先考虑那些最有可能与苦味受体结合的肽段。最终，选定的肽段进行了动力学模拟和体外细胞验证实验。这种方法系统地阐明了核桃肽在原子结合和信号激活水平上的苦味机制，为植物蛋白苦味的研究提供了新的见解。

章节摘录

植物材料、化学品和试剂

核桃蛋白（Juglans sigillata D.）来自中国陕西的西安旭龙生物技术有限公司。胰凝乳蛋白酶（10×10⁵ U/g）购自中国的上海麦克林生物科技有限公司。高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）购自美国的Thermo Fisher Scientific公司，胎牛血清（FBS）购自中国的兰州荣业生物技术有限公司，Lipofectamine 3000转染试剂购自美国的Invitrogen公司，青霉素-链霉素

BitterX预测

我们之前的研究已经证实，用胰凝乳蛋白酶处理后的核桃蛋白水解物在所有测试酶中显示出最强的苦味，使其成为研究核桃蛋白苦味的理想候选物。然而，导致其复杂苦味的肽之间的协同机制以及它们与苦味受体的具体相互作用仍需进一步探索。因此，本研究系统地识别了代表性的苦味肽

结论

本研究系统地分析了核桃蛋白水解物中的苦味肽，使用BitterX检测到725种核桃肽中的596种潜在苦味肽（占82.2%）。进一步研究表明，T2R1、T2R14和T2R41是负责核桃苦味的关键受体蛋白，占累积结合频率的99.3%。结合分子对接和动力学模拟，我们发现LHFR、KIV10和LIG9与其相应受体形成了稳定的复合物

CRediT作者贡献声明

张莉：撰写——原始草案、方法学、调查、数据管理、概念化。龚婉颖：数据管理。王文静：可视化、资源准备。张伟涛：验证。杨倩倩：资源准备。谢静：撰写——审稿与编辑、项目管理。田阳：资金获取。

机构审查委员会声明

根据云南农业大学人类伦理委员会的监管指南，食品感官评估研究无需伦理批准。所有实验程序均符合《赫尔辛基宣言》中规定的伦理原则。每位评估者在参与感官评估前均已获得口头知情同意。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了云南省星电人才支持计划-青年人才专项（XDYC-QNRC-2023-0405）、国家自然科学基金项目（32560534）、云南省农业联合项目（202401BD070001-011）以及云南省 Ten Thousand Plan 工业技术人才项目（YNWR-CYJS-2020-010）的支持。

我们衷心感谢昆明植物研究所天然产物生物活性筛选中心的支持

张莉|龚婉颖|王文静|张伟涛|杨倩倩|谢静|田阳