《Food and Waterborne Parasitology》：Presence of red foxes and contamination with
Echinococcus multilocularis on soft fruit farms in Limburg, the Netherlands
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摘要：多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）（狐狸绦虫），以赤狐为主要终末宿主，是欧洲一种重要的食源性寄生虫，并在荷兰呈新现态势。尽管野生浆果的消费常被宣传为食源性多房棘球绦虫感染的风险因素，但商业种植软水果的污染情况仍鲜有研究
摘要：多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）（狐狸绦虫），以赤狐为主要终末宿主，是欧洲一种重要的食源性寄生虫，并在荷兰呈新现态势。尽管野生浆果的消费常被宣传为食源性多房棘球绦虫感染的风险因素，但商业种植软水果的污染情况仍鲜有研究。本研究评估了荷兰流行区林堡省商业软水果农场的狐狸存在情况及多房棘球绦虫污染状况。在2024年收获季节（6月至8月），研究人员在14个农场的22块地块上采集了220份软水果样品和220份土壤样品。通过红外相机和粪便分子分析，确认50%的农场有狐狸存在，镜头显示狐狸活跃地在果实上觅食。采用洗涤、沉淀、DNA提取以及针对12S线粒体基因短片段特异性qPCR的方法，研究人员在10/220份（4.5%；95%置信区间：2.5–8.2%）软水果样品中检测到多房棘球绦虫DNA，所有阳性样品的浓度均较低。单变量分析表明，较长的收获期、高架栽培架的存在、防雨罩的使用以及落果的清理与污染显著相关（所有p < 0.05）。此外，草莓上的污染似乎比其他软水果更常见（p = 0.05）。由于仅检测到多房棘球绦虫DNA，无法就寄生虫材料的活性或感染性得出结论。此外，对污染潜在预测因子的解释仍不明确。然而，狐狸在软水果农场的存在表明了潜在的污染源，并凸显了进一步研究以减少户外种植水果污染风险策略的重要性。
一、研究背景与目的
多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis），俗称狐狸绦虫，是一种人兽共患的蠕虫寄生虫，在欧洲被视为最重要的食源性寄生虫之一。其终末宿主主要为赤狐（Vulpes vulpes），中间宿主为啮齿动物。人类作为偶然的中间宿主，误食虫卵后可能发展为泡型包虫病（Alveolar Echinococcosis, AE），这是一种严重的、可致命的肝脏疾病，若不治疗，15年后死亡率超过90%。该病在全球每年导致约66万伤残调整寿命年（Disability Adjusted Life Years, DALYs）的疾病负担，具有重大的公共卫生影响。
自20世纪90年代以来，多房棘球绦虫的地理分布范围持续扩大，荷兰已成为其新兴流行区，尤其是在南部林堡省，狐狸中的感染率高达59%。此前研究表明，食用未经清洗的水果蔬菜是感染AE的重要风险因素。虽然野生浆果的消费常被认为是高风险行为，但对商业化种植的软水果（如各种浆果）的污染状况研究甚少。鉴于林堡省既是多房棘球绦虫的高流行区，又拥有密集的软水果农场，形成了独特的流行病学背景。因此，本研究的主要目的是：1）通过红外相机和粪便分子分析，评估林堡省商业软水果农场中狐狸的活动程度；2）检测这些农场中软水果本身及其环境（土壤）的多房棘球绦虫污染水平。
二、研究方法
研究人员采用了多项关键技术方法。首先，在2024年6月至8月的收获季节，从荷兰林堡省南部和中部14个农场的22块地块上，采集了220份软水果样品（包括草莓、蓝莓、覆盆子、红醋栗等）和220份土壤样品。其次，通过在每个农场放置两台红外相机（设定夜间工作模式）记录野生动物活动，并系统收集疑似食肉动物粪便进行物种鉴定（基于多重qPCR）和多房棘球绦虫DNA检测。第三，开发并验证了一套针对软水果和土壤的多房棘球绦虫分子检测方法，包括优化洗涤、沉淀步骤，使用DNeasy Blood & Tissue Kit或QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit提取DNA，并通过针对12S线粒体基因片段的特异性qPCR进行检测，同时设立内部竞争性扩增对照以排除抑制物干扰。最后，采用费希尔惩罚似然逻辑回归（Firth's penalized likelihood logistic regression）进行单变量风险因素分析。
三、研究结果
3.1 验证实验
加标实验结果显示，不同水果类型的检测效率差异显著。红醋栗的单个虫卵检出概率最高（100%），而黑莓最低（12.5%）。对于土壤，不同土壤类型间的检测效率无显著差异，总体95%检出限（LOD95）约为8.3个虫卵/10克土壤。
3.2 农场特征
参与研究的14个农场中，一半采用露地种植，其余使用花盆（29%）或高架栽培架（21%）。地块面积范围为0.05至2.2公顷，收获期从1个月到7个月不等。
3.3 狐狸活动
红外相机记录了781次独立事件，其中赤狐占14%（109次），出现在6个农场（43%）。狐狸的相对丰度指数（Relative Abundance Index, RAI）在7至165之间。此外，在56份经鉴定的粪便样品中，6份（10.7%）确认为狐狸粪便，分布在4个农场。综合两种方法，共有7个农场（50%）发现了狐狸存在的证据。相机还拍到狐狸主动觅食和吃水果的画面。
3.4 野外样品检测
在220份水果样品中，有10份（4.5%；95% CI: 2.5–8.2%）通过qPCR检测到多房棘球绦虫DNA，包括草莓、覆盆子和红醋栗。其中3份样品通过nad1多重PCR和桑格测序得到确认。这10份阳性样品来自5个农场（35.7%），分布于南林堡和中央林堡。所有阳性样品的qPCR循环阈值（Cq值）均较高（>36），表明DNA浓度极低。在220份土壤样品中，未检测到多房棘球绦虫DNA。所有粪便样品也均为阴性。
3.5 风险因素分析
单变量分析发现，四个因素与水果污染显著正相关：更长的收获期、使用防雨罩、采用高架栽培架以及主动清理落果。此外，草莓相比其他水果表现出边界显著的更高污染风险（p=0.05）。值得注意的是，这些显著变量之间存在关联，例如高架栽培架常用于草莓并配合防雨罩以延长收获期，表明可能存在混杂效应。狐狸的相机检测结果与水果污染之间未发现显著关联。
四、讨论与结论
本研究表明，在林堡省的商业软水果农场中，狐狸的存在相当普遍（50%），并且确实有狐狸在果园内觅食。尽管未在粪便和土壤中检出虫卵，但在4.5%的水果样品上检出了多房棘球绦虫DNA，这与国际上0-7%的污染率范围相符。然而，由于仅检测到DNA而非活卵，且Cq值很高（相当于少于一个虫卵的DNA量），因此无法直接推断对人类健康的风险。动物模型显示，口服20个虫卵也未导致小鼠感染，提示实际感染剂量可能较高。
研究结论指出：虽然食品安全影响尚不明确，但本研究证实了林堡省至少半数研究农场有狐狸活动，并再次确认了在该地区种植的软水果上存在多房棘球绦虫DNA。这强调了进一步研究预测因子作用、提高生产者和消费者（特别是在高流行区）认知的必要性。未来应探索减少水果污染风险的策略，例如阻止狐狸进入或清除粪便。对于消费者，在流行区建议彻底清洗或烹饪水果蔬菜，以降低食源性暴露风险。加热处理仍是确保完全灭活虫卵的唯一可靠方法。
