《European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics》：Tumor-responsive hyalo-chitosan nanoparticles for targeted delivery of andrographolide in CD44+ breast cancer cells
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•透明质酸包被壳聚糖纳米粒克服了穿心莲内酯递送障碍。•透明质酸包被促进了 CD44 介导的乳腺癌细胞主动靶向。•优化的壳聚糖纳米粒显示出模拟肿瘤微环境的 pH 响应性释放。•共聚焦成像证明了透明质酸功能化纳米粒的细胞摄取增强。•凋亡和生物标志物检测揭示了潜在的抗肿瘤机制。引言
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透明质酸包被壳聚糖纳米粒克服了穿心莲内酯递送障碍。
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透明质酸包被促进了 CD44 介导的乳腺癌细胞主动靶向。
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优化的壳聚糖纳米粒显示出模拟肿瘤微环境的 pH 响应性释放。
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共聚焦成像证明了透明质酸功能化纳米粒的细胞摄取增强。
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凋亡和生物标志物检测揭示了潜在的抗肿瘤机制。
引言
乳腺癌（BC）被认为是癌症相关死亡的第二大原因，全球估计死亡率为 11% [1]。近期研究报告称，全球乳腺癌（BC）诊断病例超过 230 万例，死亡人数超过 50 万例 [2]。在乳腺肿瘤疾病中，乳腺组织细胞开始不受控制地生长，产生异常肿块，可能表现为良性或恶性肿瘤 [3]。乳腺癌的发生与不良生活方式选择、环境因素以及心理社会因素有关。基因突变和家族史占乳腺癌病例的 5% 至 10%，而可改变因素占病例的 20% 至 30% [4]。人表皮生长因子受体 2（HER2）、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和 Ki-67 核蛋白的表达水平通常用于将乳腺癌分类为分子亚型。这包括；HER2 富集型（ER?, PR?, HER2 + ），三阴性（TN）乳腺癌（ER?, PR?, HER2? ），腔面型 A（ER + 和/或 PR+, HER2?, 低 Ki-67）和腔面型 B（ER + 和/或 PR+, 伴有高 Ki-67 的 HER2?或伴有任意 Ki-67 状态的 HER2 + ）[5]。乳腺癌的主要治疗模式包括手术、放射治疗、干细胞治疗、免疫治疗、激素治疗和化疗 [6]。化疗药物多种多样，包括烷化剂（卡铂、顺铂、奥沙利铂、环磷酰胺、美法仑）[7]，抗代谢药（巯嘌呤、氨基蝶呤、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、硫鸟嘌呤）[8]，抗有丝分裂剂（紫杉醇、长春碱）[9]，以及抗肿瘤抗生素（多柔比星、博来霉素、丝裂霉素 C）[10]。根据世界卫生组织（WHO），化疗由于脱靶活性而与即时和长期毒性有关。即时效应可能涉及骨髓、肾脏、皮肤、血液、毛发以及大脑、心脏、神经和肺部等关键器官 [11]。植物药被认为是最古老形式的医疗，使用整株植物或特定植物部分来管理广泛谱系的致残性疾病。对传统疗法的毒性和不良反应的担忧导致全球约 80% 的人口依赖草药疗法作为主要医疗资源，这一趋势仍在不断扩大。这种不断增长的需求同时也推动了草药制药生产和商业化的大幅增长 [12]。许多植物药富含具有强抗炎和抗癌活性的生物活性化合物。在乳腺癌中，几种药用植物在疾病的不同阶段显示出值得注意的疗效，影响癌细胞生长、存活和进展。它们的抗癌作用通过几种机制实现，包括增强抗氧化防御、灭活致癌物、诱导细胞周期停滞和凋亡以及调节免疫反应，突显了其在化学预防和治疗策略中的前景 [13]。穿心莲内酯（AG）是从穿心莲全草中提取的主要生物活性二萜内酯（图 1）[14]、[15]。近期研究强调了 AG 针对乳腺癌的抗肿瘤活性。它已被证明能限制侵袭行为，减缓细胞周期进展并触发程序性细胞死亡 [16]、[17]、[18]、[19]。其生物活性主要源于其二萜内酯结构，从而产生显著的抗癌作用 [20]。然而，AG 在生物药剂学分类系统（BCS）中被归类为 IV 类药物，存在低溶解度、肠道渗透性差以及约两小时的短半衰期问题 [21]。此外，根据生物药剂学药物处置分类系统（BDDCS），AG 表现出 II 类药物的行为，这主要是由于广泛的首过代谢 [22]、[23]。其高的血浆蛋白结合率和短的平均滞留时间进一步降低了生物利用度 [24]。这些缺点强调了优化递送途径以提高 AG 治疗性能的迫切需求。植物纳米技术可能是最大化草药化合物治疗效果的可行方法。纳米载体可以通过包裹这些植物药物来改善它们的药代动力学和药效学特性，从而增强稳定性、溶解度和生物利用度 [25]。此外，其他益处包括能够进行部位特异性靶向、增强细胞摄取、优化生物分布、控制药物释放和持续释放以及减少全身毒性 [26]。各种纳米载体已被尝试用于 AG 递送，如固体脂质纳米粒（SLNs）[27]、聚（乳酸 - 乙醇酸）（PLGA）纳米粒 [28]、乳糖 β-环糊精纳米粒（ALN-βCD）[29]、丝素蛋白纳米粒 [30]、白蛋白纳米粒（ANPs）[31]、与水杨酸形成的纳米共晶（AG-SLA）[32] 和纳米乳 [33]。然而，每种平台都存在固有的局限性；SLNs 容易发生药物负载量低以及在储存过程中药物排斥的情况 [34]。PLGA 纳米粒涉及复杂的多步制备，限制了可扩展性和批次一致性 [35]。环糊精基载体载药能力有限，且在较高剂量下可能表现出毒性 [36]。丝素蛋白系统面临灭菌挑战 [37]。白蛋白纳米粒尺寸不一，影响释放和生物分布 [38]。纳米共晶和纳米乳遇到稳定性问题 [39]、[40]。考虑到这些缺点，定制一种能充分发挥 AG 治疗效果的纳米载体至关重要。最常用的纳米载体之一是壳聚糖纳米粒（CS-NP）。壳聚糖（CS）是一种线性阳离子多糖，主要由通过 β-(1 → 4)-糖苷键连接的随机分布的 D-氨基葡萄糖和 N-乙酰 -D-氨基葡萄糖单元组成。它通常通过几丁质的部分脱乙酰化获得 [41]、[42]。此外，CS 可生物降解、具有生物相容性且毒性低，使其成为安全治疗用途的有吸引力选择。而且，它具有强黏膜黏附性，这延长了在靶部位的滞留时间并增强了药物吸收 [43]、[44]、[45]。靶向递送对于最大化抗癌剂的治疗效果和最小化全身毒性至关重要 [46]。用特定配体修饰纳米粒表面允许选择性结合癌细胞上过度表达的受体。在展示乳腺癌靶向方面，透明质酸（HA）、抗体和叶酸是常用的配体 [47]。HA 是一种天然存在的、带负电的、亲水性黏多糖，由 N-乙酰 -D-氨基葡萄糖单元和 D-葡萄糖醛酸组成。据报道，它表现出对 CD44 的强亲和力，CD44 是在癌细胞上高度表达的受体，特别是在乳腺癌等实体瘤中 [48]、[49]、[50]。结合到 CD44 后，HA 形成通过受体介导的内吞作用被吞入的复合物 [51]。因此，本研究旨在开发 pH 响应性基于壳聚糖的纳米粒以增强 AG 的溶解度和渗透性，并在表面修饰 HA 以实现 CD44 受体介导的肿瘤靶向。据我们所知，此前没有报告涉及一种双功能纳米载体，将 pH 响应性释放与 CD-44 主动靶向相结合，用于将 AG 递送至乳腺癌细胞。对载药透明质酸壳聚糖纳米粒进行了全面的体外研究。使用 MCF-7 细胞株进行的细胞培养研究证实了靶向能力、改善的细胞摄取和改善的凋亡，这揭示了潜在的抗癌机制。
章节摘要
材料
壳聚糖（分子量：1526.5 g/mol，脱乙酰度：81.38%）购自 Primex BioChemicals AS（挪威阿夫尔恩斯）。透明质酸（分子量 = 60 KDa）购自康凯生物工业（中国南京），三聚磷酸钠（TPP）购自 Kristata（印度尼西亚西爪哇岛万隆）。穿心莲内酯（AG；CAS 号：5508–58-7；纯度 99.7%）购自中国宝鸡国康生物科技有限公司。所有其他试剂和化学品均为分析纯。
饱和溶解度
AG 根据生物药剂学分类系统（BCS）被归类为 IV 类药物，反映了其低水溶性和差渗透性。AG 在水、PBS（pH 7.4 和 pH 5）中显示出较低的饱和溶解度，分别为 9.99 ± 0.65、12.047 ± 0.202 和 10.566 ± 0.351 mg%。这些结果与之前的研究一致，由 Roy P et al. (2013) 和 Elsheikh MA et al. (2021) 证明，他们强调了有限的溶解度和口服生物利用度
结论
透明质酸修饰的壳聚糖纳米载体克服了穿心莲内酯递送面临的许多挑战，包括提高水溶性和增强靶向细胞摄取。优化的纳米平台产生了更明显的促凋亡活性以及对 MCF-7 细胞更强的细胞毒性效应，由生物标志物分析和成像研究证实。因此，AG-Hyalo-CS-NPs 是一种智能杂化纳米平台，结合了 pH 响应性行为与 CD-44 介导的
CRediT 作者贡献声明
Sohaila A. Shoala：写作 – 初稿，资源，方法论，调查，形式分析，数据整理。Haidy Abbas：可视化，监督。Heba M. Elbedaiwy：写作 – 审查与编辑，监督，数据整理。Marium M. Shamaa：监督，方法论，调查，形式分析。Manal A. Elsheikh：写作 – 审查与编辑，监督，资源，方法论，概念化。
利益冲突声明
作者声明，他们没有任何已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本论文报告的工作。
致谢
作者衷心感谢其导师、同事和相关机构在准备本手稿期间提供的支持和指导。我们也感谢所有直接或间接为本工作做出贡献的人。
Sohaila A. Shoala|Haidy Abbas|Heba M. Elbedaiwy|Marium M. Shamaa|Manal A. Elsheikh
