基于多组学整合与定量毒效学建模的聚六亚甲基胍诱导人肾HK-2细胞毒性机制研究

《Emerging Contaminants》：Integrated experimental, modeling, and transcriptomic approaches to characterize polyhexamethylene guanidine-induced cytotoxicity in human renal HK-2 cells

　　

聚六亚甲基胍（polyhexamethylene guanidine, PHMG）是一种阳离子聚合物杀菌剂，与严重的肺脏和肾脏毒性相关。然而，其肾毒性的细胞和分子机制仍知之甚少。本研究旨在利用体外实验、数学模型和基于转录组的系统分析，定量表征PHMG诱导的人肾近端肾小管上皮细胞（HK-2）的细胞毒性及相关分子响应。研究人员将HK-2细胞暴露于递增浓度的PHMG（0.1–20 μg/mL）长达72小时，定量检测了细胞活力、细胞凋亡和活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成。利用Weibull–Hill定量模型表征了时间和浓度依赖性毒性特征。通过核糖核酸测序（ribonucleic acid sequencing, RNA-seq）鉴定差异表达基因并进行转录组学分析，随后构建了蛋白质–蛋白质相互作用（protein–protein interaction, PPI）网络。PHMG暴露诱导了剂量和时间依赖性的细胞活力下降，伴随ROS生成和细胞凋亡升高。毒效动力学模型定量表征了浓度和时间依赖性细胞毒性谱，且模型拟合良好。转录组学分析显示，DNA复制、染色体分离和细胞周期检查点通路显著下调，同时氧化还原酶复合物、三羧酸循环和三磷酸腺苷合成通路上调。PPI网络分析确定了与细胞周期调控、氧化应激响应和蛋白质稳态相关的网络枢纽候选基因，而用于实时定量聚合酶链反应验证的代表性基因支持了转录组学发现。转录组学和网络分析进一步提示与细胞周期调控改变、线粒体代谢程序和蛋白质稳态相关应激响应相关联。这种互补方法将细胞毒效动力学（toxicodynamics, TD）的定量表征与转录组学情境化相结合，并支持利用基于生理的药代动力学–毒效动力学（physiologically based toxicokinetic–TD, PBTK–TD）建模进行进一步的暴露导向解读。

一、研究背景与科学问题

肾脏与肝脏、肺脏共同构成机体暴露于有毒化学物质后的关键靶器官。近端肾小管上皮细胞（proximal tubule epithelial cells, PTECs）参与肾小球滤过后的排泄与重吸收过程，对直接暴露于外源性物质高度敏感，是包括药物性肾损伤在内的肾毒性发生的主要部位。人肾近端肾小管上皮细胞系（HK-2）被广泛用于体外研究细胞生长、转运体表达及细胞应激响应，但该模型存在分化程度低、转运体表达差异等局限，难以完全模拟人体肾组织，尤其在复杂毒性或长期暴露研究中更为突出，因此需要定量建模方法以合理解读体外实验结果并提升预测准确性。

聚六亚甲基胍（polyhexamethylene guanidine, PHMG）是一种聚合消毒剂，在加湿器消毒剂事件中其毒性受到高度关注。PHMG暴露可导致多种组织损伤，包括肺损伤。动物和细胞研究已报道其可增加氧化应激、激活凋亡通路并诱导炎症反应。尽管PHMG毒性研究主要集中于呼吸道暴露，现有毒代动力学（toxicokinetic, TK）证据表明PHMG在特定实验条件下可发生全身分布，放射性示踪生物分布研究亦提供了直接证据。然而，全身摄取的程度和动力学强烈依赖于给药途径，侵入性给药、气管内（intratracheal, IT）暴露和口服给药在吸收效率、递送剂量和组织分布方面不应视为等同。目前尚无证据表明环境相关PHMG暴露可导致肾脏浓度达到本研究HK-2细胞所用名义浓度水平，因此肾脏受累应被视为PHMG全身分布后一种可能但尚未充分表征的后果。

既往研究主要集中于PHMG在肺组织或肺细胞模型中的毒性机制，关于PHMG在肾细胞中毒性的研究甚少，特别是在浓度-时间依赖性、定量预测模型及分子水平机制分析方面存在明显空白：环境相关暴露条件下PHMG到达肾脏的程度尚未明确；PHMG诱导的肾小管细胞毒性响应尚未充分表征；此类细胞响应的浓度-时间依赖性尚未得到定量描述；体外肾细胞响应向人体暴露的外推仍是需要进一步验证的独立建模挑战。为此，本研究旨在：系统测量不同浓度和时间条件下PHMG暴露HK-2细胞的体外细胞毒性响应；通过构建Weibull–Hill毒效动力学（toxicodynamics, TD）模型定量描述PHMG的浓度-时间-响应关系；通过RNA测序（RNA-seq）转录组分析鉴定PHMG暴露诱导的基因表达变化，并通过基因本体论（Gene Ontology, GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）和蛋白质–蛋白质相互作用（protein–protein interaction, PPI）网络确定主要毒性通路和枢纽基因；表征与PHMG诱导HK-2细胞毒性相关的转录组和网络水平分子响应；探索将新建立的HK-2 TD模型与既有基于生理的药代动力学（physiologically based toxicokinetic, PBTK）框架相连接，以在重复PHMG暴露情景下对肾脏暴露和相应细胞毒性响应进行基于模型的情境化解读。

二、主要技术方法

研究人员采用多终点体外毒性评估体系，包括CCK-8细胞活力检测、实时活细胞成像、Annexin V流式细胞术凋亡分析、碘化丙啶（propidium iodide, PI）细胞周期分析及DCFDA活性氧（reactive oxygen species, ROS）检测。在定量建模方面，构建了Weibull–Hill联合浓度-时间TD模型，并采用近似两阶段混合效应分析表征IC₅₀和k的异质性，通过拟合优度检验、残差分析及Bootstrap不确定性分析评估模型性能。在转录组学层面，对PHMG（10 μg/mL）处理48小时的HK-2细胞（每组3个独立生物学重复）进行Illumina NovaSeq双端测序，经HISAT2比对至GRCh38参考基因组，采用DESeq2进行差异表达基因（differentially expressed gene, DEG）鉴定，并开展GO、KEGG富集分析及全转录组基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）。基于BioGRID数据库构建PPI网络并进行网络随机游走传播以识别枢纽候选基因，最后通过实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR, qPCR）验证代表性基因表达。

三、主要研究结果

3.1 PHMG对HK-2的细胞毒性效应

CCK-8检测显示PHMG诱导浓度和时间依赖性的细胞活力下降，在0.1–1 μg/mL暴露24小时内无显著变化，而浓度≥5 μg/mL时48小时后细胞活力显著降低，20 μg/mL时48–72小时活力锐减至20%以下。活细胞成像观察到≥5 μg/mL处理组细胞出现变圆、收缩、细胞间黏附减弱及脱落漂浮等形态学退化。Annexin V/PI流式分析显示凋亡细胞呈浓度和时间依赖性增加，5 μg/mL处理48小时早期凋亡细胞超过10%，Sub-G1亚群显著增加提示DNA片段化相关的晚期凋亡。DCFDA检测显示ROS水平在5 μg/mL时升高约1.5倍，20 μg/mL时超过2倍，72小时累积最为显著。

3.2 Weibull–Hill浓度-时间模型定量表征

研究人员建立了Weibull–Hill联合浓度-时间模型，结构参数估计为：E₀ = 96.29%，E_max = 8.95E^-15%，IC₅₀ = 14.05 μg/mL，Hill系数h = 3.21，时间尺度因子k = 4.54E^-2，时间形状参数m = 1.15。模型拟合R² = 0.93–0.95，视觉预测检查确认模型预测百分位区间覆盖观测数据，残差呈正态分布且无系统偏差。模型模拟显示PHMG毒性在初始12–24小时逐渐增加，48小时后快速加速，浓度约5 μg/mL及以上时细胞活力降至50%以下。

3.3 RNA-seq数据质控与预处理

测序数据表现出高碱基质量（Q30 > 97%）、高比对效率（> 98%）、GC含量49.07%–49.56%，样本间Pearson相关系数超过0.99，层次聚类和多维尺度分析显示对照组与处理组清晰分离，确认数据高质量且生物学重复高度一致。

3.4 DEG鉴定

共鉴定出744个DEG，其中389个上调、355个下调。线粒体tRNA和rRNA位点（TRNF、TRNV、RNR1、TRNI、TRNP）呈现极端上调信号（约30–2688倍），但研究人员对此谨慎解读，不视为线粒体翻译活性增加的直接证据。CSF2、IL18、LIPG、SCN3A、SUCNR1为最显著下调基因（约5.8–8.0倍下降），涉及炎症细胞因子产生、脂质代谢、离子通道功能和代谢受体信号。

3.5 GO富集分析

生物学过程方面，"解剖结构发育"和"发育过程"为最显著富集项，同时"对刺激的响应"和"细胞对刺激的响应"位列前茅，代表性基因包括CSF2、IL18、GADD45A、DDIT3、NQO1、HMOX1。细胞组分方面富集于"细胞外围"、"质膜区域"和"细胞外空间"。分子功能方面"蛋白质结合"、"氧化还原酶活性"和"细胞因子活性"显著富集，HMOX1、NQO1、SOD2、TXNRD1的上调与ROS升高相对应。经术语大小过滤后主要富集主题保持稳定。

3.6 KEGG通路富集分析

最显著富集通路为氨酰-tRNA生物合成（FDR = 2.9 × 10^-14）、细胞周期（FDR = 8.9 × 10^-9）和运动蛋白（FDR = 1.3 × 10^-7）。补体和凝血级联、中性粒细胞胞外陷阱形成、细胞因子-细胞因子受体相互作用等免疫炎症相关通路显著富集。钙信号通路和肌动蛋白细胞骨架调控亦发生改变。代谢相关通路包括矿物质吸收和酒精中毒通路，反映金属离子和NAD⁺/NADH平衡相关的氧化还原调控网络变化。

3.7 全转录组GSEA

GO分析显示能量代谢、分泌和转运通路上调，而细胞周期和DNA复制相关通路下调。细胞组分层面线粒体内膜和氧化还原酶复合物上调，细胞分裂结构相关组分下调。分子功能层面抗氧化和氧化还原酶活性上调，核和细胞骨架相关结合及磷酸化活性下调。KEGG GSEA显示产热、心肌收缩、细胞色素P450异物代谢等能量和药物代谢程序正富集，DNA复制、细胞周期、间隙连接等负富集。Reactome分析显示核糖体扫描和起始密码子识别、TCA循环和呼吸电子传递、ATP生成等通路正富集，细胞周期有丝分裂、DNA双链断裂修复、Rho GTP酶信号等负富集。

3.8 PPI网络与枢纽基因鉴定

PPI网络显示不对称度分布，聚类系数0.46，平均路径长度3.27。网络随机游走传播识别出10个高排名枢纽候选基因：CDK2和TP53（细胞周期调控与DNA损伤响应）、HNRNPL和ELAVL1（RNA结合与转录后调控）、UBC、TRIM25和BAG3（泛素化与蛋白质降解调控）、LMNA（核结构稳定性维持）和EGFR（受体信号通路调控）。qPCR验证了CDK2、HNRNPL、ELAVL1、TRIM25、BAG3的表达变化，支持转录组学发现。

四、讨论与结论

研究人员将新建立的HK-2 TD模型与既有PBTK模型相连接，在5个外暴露水平（0.25、2.5、25、250和2500 μg/day）下模拟每日一次重复气管内暴露2160小时的肾脏浓度及相应细胞毒性响应。这些外剂量情景跨越多个数量级，用于探索模型行为，而非代表既定或典型的环境人体暴露水平。模拟用于检验预测的肾脏暴露增加是否可能接近HK-2模型中与细胞毒性相关的浓度范围，而非估计实际人群暴露或肾脏风险。

研究结论表明，PHMG暴露诱导HK-2细胞发生浓度和时间依赖性的细胞活力下降，伴随ROS生成增加和细胞凋亡。Weibull–Hill毒效动力学模型定量表征了浓度-时间依赖性细胞毒性谱，模型拟合良好。转录组学分析揭示DNA复制、染色体分离和细胞周期检查点通路显著下调，同时氧化还原酶复合物、三羧酸循环和ATP合成通路上调。PPI网络分析确定了与细胞周期调控、氧化应激响应和蛋白质稳态相关的网络枢纽候选基因。这种互补方法将细胞TD的定量表征与转录组学情境化相结合，为后续基于PBTK的暴露转化提供了探索性基础。由于实验观察来自单一永生化细胞系且暴露时长不超过72小时，人体肾脏暴露估计为模型推导，本研究结果应被解读为细胞危害表征和暴露情境化，而非定量的人体肾脏风险评估。在应用于定量风险评估或监管决策前，需要利用生理相关的肾脏模型、实测内部剂量学和环境相关暴露情景进行进一步验证。