睡眠限制诱导大鼠远端结肠组织构象与细胞重塑：昼夜节律紊乱的外周后果

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Sleep restriction induces histoarchitectural and cellular remodeling in the rat distal colon: a peripheral consequence of circadian disruption

　　

睡眠限制破坏昼夜节律组织，是一种具有超越中枢神经系统之外系统性后果的行为状态。本研究评估了持续睡眠限制条件下大鼠远端结肠的结构与细胞变化。16只雄性褐家鼠（Rattus norvegicus）被分为对照组（n=8）或睡眠限制组（n=8），并采用改良多平台法处理21天。采集血液样本进行炎症评估，并采用组织化学和免疫组织化学方法分析远端结肠。睡眠限制大鼠表现出体重增长减少和多形核白细胞（polymorphonuclear leukocytes, PMN）比例增加。在远端结肠中，睡眠限制增加了黏膜厚度和隐窝深度，耗竭了杯状细胞（goblet cells），并引起肥大细胞（mast cells）增生。此外，睡眠限制还导致肌间神经丛和黏膜下神经丛中神经元及肠胶质细胞（enteric glial cells）的数量和形态计量学改变。值得注意的是，这些改变发生在无明显宏观黏膜损伤的情况下。综上，这些发现表明，持续睡眠限制促进远端结肠组织构象、上皮组成、免疫相关细胞及肠神经-胶质组织的协同重塑。考虑到睡眠限制扰乱昼夜节律同步化并改变摄食等行为模式，这些结果支持肠道重塑是昼夜节律紊乱的外周后果这一概念。

论文解读：睡眠限制对大鼠远端结肠组织构象与细胞重塑的影响

一、研究背景与科学问题

睡眠-觉醒周期是哺乳动物维持心理与生物稳态的基础节律过程。睡眠不足不仅影响中枢神经系统功能，还可通过多种途径对全身多个系统产生广泛影响。昼夜节律由下丘脑视交叉上核这一中枢起搏器协调，同时外周同步因子如摄食行为也对胃肠运动、分泌及黏膜组织发挥重要调节作用。睡眠剥夺与睡眠限制可破坏昼夜节律组织，并与中枢神经系统及肠神经系统功能障碍相关。肠神经系统由肌间神经丛和黏膜下神经丛中的相互连接神经节构成，调控胃肠运动、分泌、上皮动态及免疫交互。既往研究表明，应激相关状态可导致肠道通透性增加和结肠运动改变，促肾上腺皮质激素释放因子及黏膜肥大细胞在其中发挥关键作用。此外，睡眠限制常伴随代谢紊乱和氧化应激增加，活性氧积累可损伤包括肠神经元在内的多种细胞类型。

尽管已有研究报道慢性睡眠限制以区域依赖性方式改变肠道形态，例如增加盲肠和近端结肠绒毛分布及远端回肠隐窝深度，但关于睡眠限制对结肠组织构象、上皮细胞组成及黏膜免疫细胞影响的研究仍然较少，尤其是远端结肠。慢性睡眠破坏已知可诱导中枢神经系统神经元改变，但在可比实验条件下其对肠神经系统的影响仍未充分表征。本研究聚焦围青春期窗口（出生后第40至61天），因为此阶段发育中的肠神经系统仍具可塑性，易受早期环境和代谢挑战影响。研究人员旨在探究持续睡眠限制是否驱动远端结肠整合上皮、免疫及神经-胶质成分的结构重塑，从而将肠道重塑表征为持续睡眠及昼夜节律相关紊乱的外周结局。

二、研究设计与主要技术方法

研究采用16只围青春期雄性Wistar大鼠，随机分为对照组（n=8）和睡眠限制组（n=8），从出生后第40天至第61天连续研究21天。睡眠限制采用改良多平台法诱导：8只大鼠共同饲养于含20个圆形平台的水箱中，平台数量超过动物数量以允许平台间移动。在快速眼动睡眠期间，肌肉张力丧失导致动物失去姿势控制而接触水面，从而引起觉醒。睡眠限制组大鼠每天在水箱中停留18小时（16:00至次日10:00），随后返回标准笼具进行6小时恢复期。对照组在整个实验期间饲养于标准笼具。实验结束后采集外周血进行白细胞计数与分类，处死后取远端结肠进行宏观评分、组织学处理、组织形态计量学分析、胶原纤维定量、上皮细胞及肥大细胞定量，以及肠神经丛全铺片免疫荧光分析。

三、研究结果

3.1 睡眠限制条件与体重增长减少及多形核细胞增加相关

睡眠限制组大鼠体重增长显著低于对照组。循环白细胞中，睡眠限制组多形核细胞较对照组增加约89%。远端结肠宏观检查未见组间可见差异，两组黏膜损伤评分均为零。

3.2 睡眠限制条件与远端结肠壁组织形态计量学改变相关

睡眠限制组远端结肠黏膜厚度增加约9%，隐窝深度增加32%，总壁厚增加。胶原纤维（I型、III型及总纤维）和可溶性胶原含量在两组间无显著差异。

3.3 睡眠限制条件与远端结肠杯状细胞耗竭及肥大细胞增生相关

上皮内淋巴细胞分布未改变，但杯状细胞比例在所有组织化学染色中均降低：PAS染色、阿尔辛蓝pH 1.0及pH 2.5染色的杯状细胞分别较对照组减少57.55%、44.62%和44.78%。相反，睡眠限制组结肠黏膜肥大细胞数量较对照组增加约61.77%。

3.4 睡眠限制条件与远端结肠肌间神经丛和黏膜下神经丛改变相关

在肌间神经丛中，每视野神经元数量增加19%，每神经节神经元数量增加32%，神经元面积分布无显著差异。肠胶质细胞每视野数量无差异，但每神经节数量增加13%，胶质细胞与神经元比值下降14%。在黏膜下神经丛中，每视野神经元数量增加35%，每神经节神经元数量增加37%，神经元面积增加22%。肠胶质细胞每视野数量增加56%，每神经节数量增加51%，胶质细胞与神经元比值无显著差异。

四、讨论与结论

睡眠限制大鼠体重增长减少与既往睡眠剥夺/限制研究中报道的体重增长减少或体重减轻一致，尽管伴随摄食增加，提示持续睡眠限制的影响并非线性，可能涉及能量消耗、代谢效率及应激相关神经内分泌信号的联合改变。由于多平台法在光暗周期大部分时间内施加不同饲养环境，睡眠限制组与对照组之间摄食行为或摄食时间可能存在差异，而摄食作为胃肠昼夜节律的强外周同步因子，这一局限需在解释全身及肠道结局时加以考虑。多形核细胞增加提示全身向固有免疫激活转变，但未检测到宏观病变，表明全身炎症改变和局部组织重塑可在无明显黏膜损伤的情况下发生。

组织形态计量学显示黏膜厚度和隐窝深度增加，但研究人员未直接测量增殖、凋亡、迁移或脱落。隐窝深度增加与黏膜厚度增加的组合可能反映上皮丢失减少、净结肠细胞产生增加伴衰老率维持，或隐窝组织构象及堆积密度改变。胶原含量无差异提示21天持续睡眠限制下的重塑反映早期动态细胞和神经-胶质重排，而非纤维性胶原沉积或确立的纤维化。

杯状细胞显著耗竭涉及中性黏蛋白和酸性黏蛋白，可能反映沿扩展隐窝轴的谱系分化转变，或由肥大细胞增生介导的黏蛋白颗粒加速排泌。肥大细胞增生与既往睡眠限制下十二指肠的报道一致，支持肥大细胞对应激相关生理状态具有响应性。多平台环境还涉及神经内分泌应激通路，下丘脑-垂体-肾上腺轴激活及促肾上腺皮质激素释放因子和皮质酮释放可独立于睡眠丢失诱导黏膜肥大细胞增生、脱颗粒和上皮通透性增加，本研究设计无法完全区分睡眠限制与应激成分。

肠神经丛分析显示两个神经丛中每视野和每神经节神经元数量均增加，并伴随神经丛特异性的胶质细胞数量和胶质-神经元比值改变。由于全铺片制备对组织张力、拉伸和纵向区域取样敏感，这些结果应主要解释为表观细胞密度和神经节细胞组成的变化，而非绝对神经元或胶质细胞总数的确定性证据。每神经节测量对纵向拉伸的敏感性低于单位面积密度，且显示相同方向变化，但睡眠限制结肠在交感激活下可能出现的轻微宏观收缩仍可能促成更高的表观密度。

本研究主要贡献在于表明持续围青春期睡眠限制与远端结肠上皮、免疫及肠神经-胶质重塑相关，即使在无宏观病变的情况下亦然。这些发现支持结肠作为睡眠和昼夜节律紊乱的外周靶器官。研究局限包括单一围青春期年龄窗口限制了对成年动物的外推、多平台模型将睡眠限制与环境应激结合，以及未纳入生化、免疫和功能分析及神经元和胶质亚群评估。综上所述，持续睡眠限制在围青春期诱导体重发育、炎症谱和肠道组织构象的整合性改变，支持肠道重塑作为昼夜节律紊乱外周后果的概念，强化了睡眠、昼夜节律调节与胃肠组织之间的密切交互。