CRISPR/Cas9介导的mstnb基因敲除促进光唇鱼肌肉生长并影响肌肉营养组成

《Aquaculture and Fisheries》：Disruption of mstnb by CRISPR/Cas9 promotes muscle growth and affects muscle nutritional composition in Acrossocheilus fasciatus

肌肉生长增强是水产养殖的关键目标。肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）是肌肉发育的保守负调控因子，也是遗传改良的重要靶点。本研究利用CRISPR/Cas9技术在淡水鱼光唇鱼（Acrossocheilus fasciatus）中敲除了mstnb基因。在F0幼鱼中观察到较高的编辑效率。在27月龄时，mstnb嵌合体F0成鱼表现出明显的双肌（double-muscling）表型，与对照组相比，体重（22.07%）、体宽（18.13%）和体高（13.02%）均有所增加。在F1子代中，mstnb突变鱼的肥满度（condition factor）比对照组高36.1%，肌纤维横截面积大29.2%，表明该生长性状具有可遗传性。初步营养分析表明，F1突变鱼肌肉中的总氨基酸和必需氨基酸含量可能增加，而脂肪酸谱基本保持稳定。综上所述，这些研究结果表明，mstnb的敲除可促进肌肉生长，并可能影响光唇鱼肌肉的营养组成。本研究支持mstnb作为遗传改良的潜在靶点，并为MSTN信号在鱼类中的多效性作用提供了初步见解。

一、研究背景与科学问题

光唇鱼（Acrossocheilus fasciatus）是一种隶属于鲃亚科（Barbinae）的小型鲤科鱼类，特产于中国安徽南部和浙江山溪，兼具食用和观赏价值，近年来在中国水产养殖中的经济重要性日益增加。然而，该物种的商业化发展受到若干生物学限制的制约，最突出的是生长速度慢、体型小和可食用肉产量低。这些挑战凸显了应用现代育种技术（如基因组编辑和基因组选择）培育具有增强商业性状的光唇鱼改良品系的必要性。

鱼类可食用产量的增加很大程度上取决于肌肉量，因此促进肌肉生长成为提高水产养殖生产效率的关键目标。肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN），又称生长分化因子8（GDF8），是转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员，是骨骼肌发育的关键负调控因子。MSTN的功能失活已在多种哺乳动物中被广泛证实可增强骨骼肌质量并诱导双肌（double-muscling）表型。由于硬骨鱼特有的全基因组复制事件，大多数硬骨鱼类拥有两个MSTN旁系同源基因，即mstna和mstnb。这两个旁系同源基因已发生功能分化：mstnb保留了肌肉生长调控的祖先功能，而mstna则演化出新的免疫功能。鉴于mstnb保守的肌肉抑制功能，其敲除或突变已成功应用于斑马鱼、日本青鳉等模式鱼类以及多种经济水产养殖物种。本研究旨在利用CRISPR/Cas9技术敲除光唇鱼mstnb基因，评估其对生长性能和肌肉营养组成的可遗传效应，为光唇鱼的遗传改良提供概念验证。

二、研究内容与主要结论

研究人员利用CRISPR/Cas9技术成功敲除了光唇鱼的mstnb基因。在F₀嵌合体成鱼中观察到明显的双肌表型，体重、体宽和体高均显著增加。在F₁子代中，突变鱼的肥满度和肌纤维横截面积显著高于野生型对照组，表明生长性状具有可遗传性。分子验证确认了mstnb在mRNA和蛋白水平上的有效敲除。组织学分析显示肌纤维肥大是肌肉增大的主要机制。营养分析初步表明，突变鱼肌肉中的总氨基酸和必需氨基酸含量显著升高，而脂肪酸谱基本稳定。这些发现阐明了Mstnb在鱼类生长调控中的保守作用，并揭示了其多效性效应，为水产养殖物种的多性状遗传改良提供了参考。

三、关键技术方法

研究人员首先通过BLASTP搜索从已发表的光唇鱼基因组组装中获取mstnb基因序列，利用CRISPR在线工具设计两个靶向第一外显子的单导向RNA（sgRNA）靶位点。通过体外转录合成sgRNA，与Cas9蛋白预组装成核糖核蛋白（RNP）复合物后，采用显微注射技术将复合物注入受精卵卵黄细胞质中，每个靶位点注射约500枚胚胎。在F₀幼鱼2月龄时进行基因分型，通过Sanger测序、TA克隆测序和ICE分析评估编辑效率和突变类型。选取6个性成熟F₀嵌合体亲本（3雌3雄）建立F₁家系，于2024年7月建立3个独立F₁家系（Batch A），2025年7月产生第二批独立群体（Batch B）。利用qPCR和Western blot验证mstnb在mRNA和蛋白水平的敲除效果，通过H&E染色和油红O（ORO）染色进行组织学分析，采用UHPLC-MS和GC-MS分别测定氨基酸和脂肪酸组成。

四、主要研究结果

3.1 F₀嵌合体创始鱼的编辑效率与突变类型分析

在2月龄随机选取的21尾幼鱼中，18尾（85.7%）检测到突变，其中mstnb-T1位点8尾（38.1%），mstnb-T2位点10尾（47.6%）。TA克隆测序分析显示，所选5尾个体在两个靶位点的突变效率均为100%，共鉴定出20种不同突变类型。ICE分析显示，6尾F₀幼鱼的插入缺失频率为86%–96%，敲除评分（knockout score）为77%–92%。对6尾F₀成鱼的尾鳍、骨骼肌和生殖细胞分析显示，所有组织均检测到72%–97%的高插入缺失频率，生殖细胞中均携带可检测突变，证实了编辑的可遗传性。

3.2 F₀嵌合体成鱼的形态特征与生长性能

对27月龄F₀嵌合体鱼（n=15）与野生型同胞（n=12）的比较显示，突变鱼体重增加22.07%（51.71±11.21 g vs 42.36±8.55 g），体宽增加18.13%（2.28±0.16 cm vs 1.93±0.17 cm），体高增加13.02%（3.82±0.19 cm vs 3.38±0.23 cm），而体长无显著差异。雌雄个体均表现出更健壮的体型。

3.3 F₁子代的突变谱与生长性能分析

Batch A中56尾F₁个体的基因分型显示突变检出率为80.4%（45尾），三个家系的编辑效率分别为72.7%、76.2%和87.5%。TA克隆分析鉴定出多种杂合和纯合突变类型。Batch B中，mstnb突变F₁鱼（n=45）的平均肥满度（K）为2.028±0.4801 g/cm³，显著高于野生型对照（1.490±0.1615 g/cm³），增加36.1%（P<0.0001），体长-体重曲线显示突变组在各体长范围内均具有更大的体重。

3.4 mstnb敲除的分子验证

qPCR分析显示，F₁突变鱼肌肉中mstnb mRNA水平显著降至野生型的约40%（P<0.05）。Western blot检测到约42 kDa的Mstnb蛋白条带在突变样品中显著减弱，蛋白水平降至野生型的约45%（P=0.0502），与mRNA数据一致。

3.5 mstnb敲除诱导骨骼肌肥大

H&E染色显示，F₁突变鱼的平均肌纤维横截面积为1.55±0.27×10³ μm²/细胞，显著大于对照组的1.20±0.15×10³ μm²/细胞（P<0.01），增加29.2%。油红O染色显示肌内脂质含量无显著差异。

3.6 肌肉氨基酸和脂肪酸谱

共定量20种氨基酸，其中5种必需氨基酸（缬氨酸Val、苯丙氨酸Phe、异亮氨酸Ile、赖氨酸Lys、蛋氨酸Met）和3种非必需氨基酸（丙氨酸Ala、精氨酸Arg、脯氨酸Pro）在突变组中显著升高。总氨基酸（TAA）和总必需氨基酸（TEAA）含量显著升高（P<0.05）。脂肪酸分析鉴定出26种化合物，总饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）含量在突变组中呈升高趋势但无显著差异，仅C22:1ω9和C22:2ω6显著升高，EPA和DHA呈升高趋势。

五、讨论与结论

讨论部分指出，MSTN是水产养殖中改善产量相关性状的关键遗传靶点，其功能失活在多种鱼类中均能促进肌肉生长，但不同物种间效应幅度和机制存在差异。高编辑效率与F₀嵌合体表型外显率之间存在关联。本研究观察到的mstnb敲除效应处于硬骨鱼类生长响应的广泛范围内，但需在稳定的基因型定义品系中进一步验证。初步营养分析结果提示Mstn在硬骨鱼类中可能具有超越生长抑制的代谢调节作用，但需更大样本量和F₂纯合子的直接代谢测量来验证。

研究结论：研究人员应用CRISPR/Cas9技术成功敲除了光唇鱼的mstnb基因，结果证明了基因敲除的成功实现，并提供了生长增强的初步证据，包括F₀嵌合体创始鱼及其F₁子代中肌肉量和肥满度的增加。研究还观察到肌肉组成的变化，提示mstnb敲除可能具有潜在的代谢效应。本研究的主要局限性在于表型分析是在遗传嵌合体和杂合个体中进行的，定量效应应视为初步观察。尽管如此，研究结果强调了mstn作为该物种遗传改良靶点的潜力，为未来培育具有增强产量和品质的光唇鱼品种提供了必要的基础和创始鱼。