抗坏血酸对17α-甲基睾酮诱导的鲫鱼（Carassius auratus）神经毒性的潜在保护作用：基于微生物群-肠道-大脑轴的研究

《Aquaculture》：Potential protective effects of ascorbic acid against 17α-methyltestosterone-induced neurotoxicity in crucian carp ( Carassius auratus): a study based on the microbiota-gut-brain axis

　　•MT可能通过MGBA发挥毒性作用，导致肠道微生物群失调、免疫抑制和脑组织损伤。•补充25毫克/千克的AA与有益肠道微生物群的恢复和免疫相关基因的上调有关。•补充25毫克/千克的AA可以通过减轻血脑屏障（BBB）相关的损伤来缓解MT引起的神经毒性。•AA可能通过调节糖酵解/糖异生途径发挥潜在的神经保护作用。

引言

水生生态系统是鱼类和其他水生生物的自然栖息地，通常会成为环境污染物的最终汇\[Barni等人，2016\]。其中，化学污染物的持续流入对淡水生态系统的结构稳定性和生态功能构成了严重威胁\[Leese等人，2021\]。大约80%的全球废水未经处理直接排放到水体中\[du Plessis，2022\]，导致大量有毒化合物进入淡水生态系统。在来自市政、农业和工业来源的排放物中检测到了超过100,000种化学物质，包括合成代谢类固醇激素、农药和其他可能对淡水生物有毒的有机污染物\[Bertram等人，2022\]。17α-甲基睾酮（MT）是一种典型的合成雄激素类固醇，可在水生生物体内引发雄激素和雌激素效应，雌性个体通常更为敏感\[Pawlowski等人，2004\]。60毫克/千克剂量的MT已被证明可以显著促进尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的生长表现，并增加雄性比例，从而产生更具经济价值的个体\[Sarker等人，2022\]。因此，MT在水产养殖中广泛用于性别控制\[Liu等人，2021a\]。然而，MT会引发免疫抑制和肝毒性，导致生物体不可逆的损伤\[Hild等人，2010\]。在我们之前的研究中，发现50纳克/升的MT浓度对水生生物的伤害最大\[Li等人，2025b\]，会引发炎症、氧化应激和免疫抑制，最终导致肝脂肪变性\[Li等人，2024a\]。此外，MT还会损害斑马鱼（Danio rerio）的神经组织，导致神经元数量减少、灰质层细胞排列紊乱以及血管淤滞\[Li等人，2025a\]。进一步的研究表明，MT暴露会改变肠道微生物群的结构，显著促进致病细菌（如鲍曼不动杆菌）的生长，损害肠道黏膜屏障，并引发肠道炎症\[Zhao等人，2025\]。这种肠道微生物群的失衡可能通过微生物群-肠道-大脑轴（MGBA）加剧神经损伤。肠道微生物通过产生短链脂肪酸（SCFAs）、神经递质（如5-羟色胺[5-HT]）及其前体来影响血液中的代谢物水平，并调节大脑功能和认知\[Chen等人，2022\]。关于创伤性脑损伤（TBI）的研究也证实，肠道功能障碍和微生物群的变化可以通过免疫、神经和激素途径加剧神经损伤\[You等人，2025\]。这些研究表明，MT可能通过干扰肠道微生物群的平衡来破坏MGBA的双向通信，从而加剧其对神经系统的毒性作用。肠道微生物可以通过多种途径影响中枢神经系统（CNS）的功能，包括代谢途径、免疫途径、内源性神经途径和神经信号通路\[Wang和Kasper，2014\]。具体来说，肠道微生物通过产生各种代谢物（如胆汁酸、SCFAs、谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）、血清素和5-HT）与CNS进行双向交流\[Qu等人，2024\]。这些代谢物通过迷走神经（VN）纤维将信号传递到大脑，从而调节神经递质水平\[Dicks，2022\]。相反，大脑也通过传出迷走神经纤维将信号传回肠道，从而调节肠道的免疫反应和功能\[Dicks，2022\]。值得注意的是，血脑屏障（BBB）的结构和功能是肠道-大脑轴双向信息传递的关键研究领域。肠道微生物通过其代谢物调节BBB的通透性\[Tang等人，2020\]，并可能影响神经递质的传递和神经活动。环境污染物（如三苯基磷酸酯和三氯生）已被证明会导致水生动物肠道内的微生物群失调和多样性减少，并通过抑制肠脑神经递质活性促进脑神经元的凋亡，最终引发神经行为异常\[Wang等人，2022；Zhang等人，2022\]。肠道微生物产生的神经递质通过血液运输到大脑，而BBB的功能决定了这些神经递质能否进入大脑并发挥作用。基于这些背景，我们设计了这项研究，首次探索在MT暴露下肠道微生物群产生的代谢物（如神经递质）如何通过血液运输到大脑，以及BBB在此过程中调节CNS功能的调节作用。

抗坏血酸（AA）是一种水溶性维生素，具有多种重要的细胞和分子功能，包括神经传导和维持CNS稳态\[Moretti和Rodrigues，2022\]。AA的应用可以缓解多种精神疾病（如精神分裂症、焦虑症和重度抑郁症）的行为和生化改变\[Buchanan等人，2024；Ferreira等人，2022\]。此外，AA可以缓解由污染物（如铅[Pb]）引起的氧化应激，部分恢复海马CA1区锥体神经元的细胞质大小，并改善树突分支或树突长度，从而保护神经元结构\[Sepehri和Ganji，2016；Zeng等人，2021\]。此外，AA补充显著增强生长、免疫力和抗氧化能力\[Kong等人，2021\]。值得注意的是，大多数硬骨鱼类无法自主合成AA，依赖于外源吸收\[Dawood和Koshio，2018\]。向尼罗罗非鱼（O. niloticus）的饲料中补充AA可以显著增加肠道绒毛的高度和杯状细胞的数量，提供更大的吸收表面积，从而改善肠道的吸收功能，并增强对病原体的免疫防御\[Abdel Rahman等人，2018\]。AA补充还可以减轻大脑中如二苯康唑等污染物的生物积累及其引起的神经发育毒性\[Zhu等人，2023\]。在水生环境中存在多种污染物（如MT）的情况下，AA作为一种有效的保护或修复剂，有助于减轻这些污染物引起的毒性，为水生生物的健康提供关键保障。

鲫鱼（Carassius auratus）是一种重要的淡水经济鱼类，具有广泛的水产养殖生产背景，在淡水生态系统中具有很强的代表性，因此被广泛用作评估环境污染物影响的生物指标\[Rossana等人，2023\]。它的健康状况与水产养殖的可持续发展以及水产产品的质量和安全性密切相关。由于其分布广泛、易于驯化以及对外源性激素的稳定和可重复的生物反应，C. auratus成为研究MT毒性作用的理想实验模型\[Yang等人，2019\]。此外，其发达的抗氧化防御和免疫调节系统使得能够敏感地评估AA对氧化应激、炎症反应和组织损伤的潜在保护作用\[Li等人，2024a\]。基于这些特征，我们假设MT暴露通过MGBA对C. auratus的神经系统产生毒性作用，而AA通过以下过程发挥其潜在的保护作用：(1) MT可能在C. auratus的肠道和脑组织中差异积累，直接损害肠道屏障完整性和CNS功能；(2) MT暴露可能引发氧化应激和炎症反应，破坏MGBA内的双向通信，从而加剧神经毒性；(3) AA可能通过恢复肠道微生物群的平衡、减轻氧化应激和保护神经元结构来缓解MT的毒性作用。为了验证这一假设，C. auratus被暴露于50纳克/升的MT和25毫克/千克的AA中21天。通过组织病理学检查、生化指标测量和神经相关基因表达分析，结合肠道16S rRNA测序和大脑转录组分析，系统研究了MT对MGBA的毒性作用和AA的潜在保护作用。

化学品和实验鱼

MT（纯度>99%）购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯），AA（纯度>99%）购自国药化学试剂有限公司（中国北京）。C. auratus的基础饲料购自通威饲料有限公司（中国四川）。将AA以25毫克/千克的名义浓度添加到基础饲料中，并充分混合以确保均匀分布。饲料制备完成后，使用特定方法确定制备饲料中的实际AA浓度。

组织病理学分析

组织学分析结果（图1A–F）显示，对照组的肠道组织结构完整，肠道绒毛排列紧密，肠道黏膜皱褶整齐，边缘光滑。相比之下，MT组显示出明显的肠道损伤，肠道绒毛严重断裂和断裂，并伴有空泡形成。此外，观察到固有肌层增厚。MT+AA组的肠道组织结构显著改善。

MT暴露会引发C. auratus的肠道屏障损伤、神经递质紊乱和细菌稳态破坏，而AA则具有缓解作用。

肠道是环境内分泌干扰化学物质（EDCs）的主要靶器官之一。水生环境中存在各种EDCs，如塑料增塑剂（Liu等人，2025）、激素类药物（Tan等人，2024）和农药（Vajargah等人，2021），可能导致病理变化，如肠道绒毛断裂、空泡形成、杯状细胞坏死和炎症细胞浸润。在本研究中，我们发现MT暴露损害了C. auratus的肠道结构。

结论

总之，C. auratus暴露于50纳克/升的MT 21天后，其肠道中致病菌莫拉克斯菌科（Moraxellaceae）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter）的相对丰度显著增加，导致肠道微生物群失调。同时，它降低了肠道免疫相关基因（如IFN-γ和IL-11）的表达，并增加了神经递质（如GABA和5-HT）的水平，导致肠道屏障功能受损，进而引发肠道氧化应激和炎症反应。

安乐死和麻醉方法

MS-222是一种广泛用于水生动物的麻醉剂，特别是在优先考虑动物福利的实验研究和安乐死程序中。使用MS-222进行麻醉时，首先将其稀释至推荐浓度（通常为25–30克/立方米），然后加入已充气24小时的水中。将鱼浸泡在该溶液中15–20分钟，观察直到达到所需效果。

作者贡献声明

Chang Hu：写作——原始草稿，概念化。
Tongyao Li：软件，方法论。
Haiyan Zhao：数据整理。
Zijun Xiong：数据整理。
Weiya Rong：形式分析。
Yibo Jia：形式分析。
Lu Cao：方法论。
Qing Liu：软件。
Weiwei Wang：软件。
Jing Song：软件。
Xianzong Wang：软件。
Yu Liu：软件。
Shaozhen Liu：写作——审阅与编辑，监督。

伦理批准和参与同意

本研究获得了山西农业大学动物护理和使用委员会（SXAU-EAW-2023F.004008249）的批准。在整个实验过程中，所有鱼都使用了三氯甲烷磺酸盐（MS-222）进行麻醉，以最小化疼痛和不适。

伦理声明

本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究获得了山西农业大学动物护理和使用委员会的批准（批准号：SXAU-EAW-2023F.004008249）。

资助

本研究得到了山西省畜禽遗传资源探索和生物技术育种重点实验室（202103021224136）、山西省渔业产业技术系统（2024QT052，2025QT028）以及山西省动物遗传资源利用与育种重点实验室的资助。

利益声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报道的工作。

致谢

我们感谢Elsevier（www.elsevier.cn）提供的英语语言编辑服务。