淀粉样蛋白β纤维化诱导的单胺类神经递质Cu(II)还原能力的激活

《Archives of Biochemistry and Biophysics》：Activation of Cu(II)-reducing ability of monoamine neurotransmitters triggered by amyloid-β fibrillization

　　

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  血清素和多巴胺对Cu(II)的还原伴随H₂O₂的生成。
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  未成纤维状的Aβ抑制血清素介导的Cu(II)还原和H₂O₂生成。
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  成纤维状的Aβ增强血清素介导的Cu(II)还原和H₂O₂生成。
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  这种由成纤维化驱动的转换同样发生在多巴胺介导的Cu(II)还原中。
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  单胺类神经递质可能介导Aβ纤维相关的氧化应激。

引言

血清素（5-HT）和多巴胺（DA）是广泛分布于中枢神经系统的单胺类神经递质。它们分别由L-色氨酸和L-酪氨酸经羟化后脱羧合成。芳环的羟化增强了它们被氧化的易感性，尤其是在存在氧化还原活性金属离子的情况下。例如，5-HT被Cu(II)氧化为不稳定的醌亚胺，后者易于转化为一种被称为5,5'-二羟基-4,4'-联色胺（DHBT）的5-HT二聚体[1]。DA同样被Cu(II)氧化，生成一种邻醌型中间体氨基色原，随后发生进一步的氧化还原和聚合反应，产生黑色色素神经黑色素[2]。多项研究表明，这些氧化产物对神经细胞具有毒性，因此5-HT和DA的氧化被认为对神经元存活有害[1]，[2]，[3]。此外，其中一些产物是不稳定的自由基中间体，被认为会产生活性氧（ROS）和蛋白质加合物，导致细胞死亡[3]，[4]，[5]。

铜是一种重要的微量元素，作为多种氧化还原酶的辅因子发挥作用，在生物系统中主要以两种氧化态存在，即Cu(II)和Cu(I)[6]。在生理条件下Cu(II)和Cu(I)之间容易发生的氧化还原循环对生物功能具有重要意义。然而，未被适当调控的铜对生物系统具有毒性。当Cu(II)在氧化性的细胞外环境中自发被还原为Cu(I)时，随后Cu(I)被重新氧化为Cu(II)的过程可能产生羟基自由基等活性氧[7]，[8]。因此，细胞外Cu(II)的还原存在通过氧化应激和DNA损伤导致细胞死亡的风险[9]。

铜离子在大脑中浓度较高，特别是在突触间隙中，在神经元去极化期间其水平可达到数百μM[10]。此外，大脑消耗大量氧气且富含不饱和脂质，使其特别容易受到氧化应激的影响[10]，[11]。尽管大脑的抗氧化系统目前仅部分被表征，但近期研究表明，某些铜结合肽有助于调节铜的氧化态。例如，内啡肽-1是一种内源性阿片肽，可同时结合Cu(II)和Cu(I)两种氧化态的铜，并可能作为抵抗铜诱导氧化应激的保护因子[12]。相应地，维持铜氧化还原稳态所必需的铜结合肽的缺乏或变性可能诱发氧化应激。

淀粉样β蛋白（Aβ）在阿尔茨海默病患者大脑中积累，是一种由淀粉样前体蛋白衍生的38-42个残基的肽段[13]，[14]，[15]。尽管无规则卷曲的Aβ单体基本上无毒，但富含β-折叠的Aβ纤维表现出显著的神经毒性[15]。在阿尔茨海默病患者的大脑中，铜和锌等金属在淀粉样斑块内积累，并已证实金属结合影响Aβ的聚集和毒性[16]，[17]，[18]，[19]。单体Aβ-Cu复合物根据pH值和其他周围环境采用多种配位模式。已知这些复合物在两种主要物种之间存在平衡：一种在较低pH下占优势（组分I），另一种在较高pH下占优势（组分II）[20]，[21]，[22]，[23]。近期动力学研究表明，组分I保留铜的氧化还原活性，是产生ROS的主要形式[23]。相比之下，组分II形成紧密配位的Cu(II)复合物，其中金属变得氧化还原非活性[23]。重要的是，尽管组分I能够支持氧化还原循环，但Aβ本身仅表现出最小的内在Cu(II)还原能力。因此，生理还原剂对于提供Cu(I)至关重要，这进而导致ROS的持续产生[24]。迄今为止报告的大多数Aβ铜结合模式都是在单体形式下表征的，对于聚集诱导的结构变化对金属结合位点可用性和局部环境的影响，仍然存在许多未知因素。为了理解Aβ诱导神经毒性的分子基础，有必要阐明在还原剂存在下Aβ聚集如何影响铜结合状态和由此产生的ROS生成能力。

在本研究中，我们研究了Aβ如何影响铜与单胺类神经递质5-HT和DA之间的氧化还原反应进程，以及这些反应过程中ROS的生成。研究结果表明，未成纤维状的Aβ_1-40抑制5-HT和DA对铜的还原，并伴随过氧化氢（H₂O₂）的形成。与此形成鲜明对比的是，成纤维状的Aβ_1-40显著促进了这些潜在有害的氧化还原反应。我们还使用分别特异性针对Cu(I)或Cu(II)的经典铜螯合剂进行了类似实验，发现铜与神经递质之间的氧化还原反应分别被Cu(I)和Cu(II)螯合剂增强和抑制。这些发现表明，单胺介导的铜还原的激活可能归因于Aβ在成纤维化过程中获得的Cu(I)结合能力。

各节内容摘要

材料

5-羟色胺盐酸盐、多巴胺盐酸盐、乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸二钠（EDTA）、双偶氮双吡啶磺酸（BC）、辣根过氧化物酶（HRP）、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸（HEPES）和三氟乙酸（TFA）购自富士胶片和光纯药工业株式会社（日本大阪）。氯化铜(II)、甘氨酸（Gly）、L-组氨酸（His）、氯化钠（NaCl）和刚果红（CR）由和光纯药株式会社供应。

Aβ_1-40对单胺与Cu(II)之间氧化还原反应的影响

通过高效液相色谱（HPLC）分析DHBT——5-HT氧化的主要产物——来评估Aβ_1-40对5-HT的Cu(II)还原活性的影响。Aβ_1-40在与5-HT和Cu(II)开始反应之前预先孵育一定时间。图1A显示了含有5-HT和Cu(II)的反应混合物在有无Aβ_1-40存在时的色谱图。DHBT是5-HT在Cu(II)介导下的氧化产物，在约12.8分钟时被洗脱。在色谱图的

讨论

公认的是，大脑中ROS的产生参与了阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的病理生理过程[31]，[32]。尽管铜离子作为众多氧化还原酶的辅因子发挥重要的生理作用，但其氧化还原反应性需要严格调控。铜离子响应神经元去极化被释放到突触中[10]。在氧化性的细胞外区室如

结论

体内铜的氧化还原平衡由各种分子因素严格调控，包括铜结合蛋白和肽。因此，它们对Cu(II)和Cu(I)结合亲和力的异常变化可能破坏铜的氧化还原稳态，并促成氧化应激相关疾病（如阿尔茨海默病）的发生发展。本研究表明，Aβ_1-40在成纤维化后显著增强了5-HT和DA对Cu(II)的还原，从而促进了

作者贡献声明

三浦卓（Takashi MIURA）：撰写——审阅与编辑，验证，监督，资源，项目管理，方法论，资金获取，数据管理，概念化。金子美波（Minami Kaneko）：调查。黑田咲（Saki Kuroda）：调查。木田咲（Saki Kitase）：调查。青木理沙（Risa Aoyagi）：调查。栗原拓海（Takumi Kurihara）：撰写——初稿，可视化，验证，调查，正式分析，数据管理

伦理审批

本研究不涉及人类参与者或动物实验，因此无需伦理审批。

参与/发表同意书

不适用。

数据和材料的可获得性

数据可按请求提供。

资金支持

本工作得到日本学术振兴会科学研究费（JSPS KAKENHI）资助，项目编号：25K09928。

资金支持

本工作得到日本学术振兴会科学研究费资助，项目编号：25K09928。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

栗原拓海|Risa Aoyagi|木田咲|黑田咲|金子美波|三浦卓