《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Divergent cellular responses to sciatic nerve crush versus transection: bilateral MYCN induction and distinct DRG neuronal responses
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引言： 周围神经损伤可因损伤方式不同而产生再生性或持续性断离的结局，但其潜在的细胞反应及其对中枢神经系统的影响尚未被完全阐明。
方法： 研究人员在野生型、AdvCre;Ai14和MYCN-eGFP报告基因小鼠中比较了坐骨神经压榨（SNC；轴索断伤）与坐骨神经横
引言： 周围神经损伤可因损伤方式不同而产生再生性或持续性断离的结局，但其潜在的细胞反应及其对中枢神经系统的影响尚未被完全阐明。
方法： 研究人员在野生型、AdvCre;Ai14和MYCN-eGFP报告基因小鼠中比较了坐骨神经压榨（SNC；轴索断伤）与坐骨神经横断（SNT；神经断伤）。纵向评估包括功能恢复、以ATF3标记的神经元损伤反应、IB4阳性感觉神经元反应、脊髓背角小胶质细胞活化以及脊髓MYCN-eGFP信号。
结果： SNC与部分、测量指标特异性的功能恢复、短暂且自限性的ATF3反应以及IB4阳性神经元轮廓的有限减少相关。相反，SNT产生持续性的轴突断离相关神经元应激、IB4阳性神经元轮廓的减少以及更为持久的脊髓背角小胶质细胞活化。在术后第7天（POD7），SNC和SNT后脊髓腹角神经元中MYCN-eGFP强度均显著高于假手术水平，且呈双侧升高，其中SNC后观察到的急性幅度最大。从POD7至POD14，SNC后MYCN-eGFP强度下降超过90%，而SNT后下降约60%，表明两种损伤方式之间存在不同的时间模式。
讨论： SNC和SNT涉及重叠但在数量和时间上不同的细胞程序，包括与功能恢复相关的损伤方式特异性背根神经节神经元反应。这些发现细化了对两种广泛使用的周围神经损伤模型的解释，并将双侧脊髓MYCN-eGFP动态变化确定为未来机制研究的候选细胞读数。
论文解读
一、研究背景与科学问题
周围神经损伤（peripheral nerve injury, PNI）是临床面临的重大挑战，常导致慢性疼痛、运动功能丧失和永久性残疾。动物模型对于解析神经变性与再生的复杂病理生理机制以及开发有效治疗策略至关重要。在众多模型中，啮齿类坐骨神经损伤模型是临床前研究的基石，为在周围神经、背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）和中枢神经系统（central nervous system, CNS）水平研究轴突损伤的分子和细胞反应提供了良好表征的平台。
该研究聚焦于两种最广泛使用的损伤模型变体：坐骨神经压榨（sciatic nerve crush, SNC），诱导轴索断伤（axonotmesis）；以及坐骨神经横断（sciatic nerve transection, SNT），即神经断伤（neurotmesis）。在SNC中，轴突连续性被破坏而周围神经内膜鞘保持完整，这种结构完整性的保留提供了引导再生轴突返回失神经支配靶标的天然支架，使其成为研究成功神经修复内在机制的可靠模型。相反，SNT切断所有神经和支持元素，形成物理间隙，阻止自发再生，更准确地反映严重完全性神经损伤的病理状态。
需要特别指出的是，该研究的SNT模型还涉及切除2–4 mm神经段且不进行手术修复，因此SNC与SNT的差异不仅在于初始损伤的严重程度，还涉及神经连续性、再生路径和再神经支配潜力。研究人员将两种模型视为再生许可性损伤与持续性断离损伤，而非单一损伤严重程度标尺上的两个点。
尽管SNC和SNT模型被广泛使用，但关于初始损伤方式如何塑造后续修复或退变的细胞反应，仍存在认知空白。文献主要集中在比较功能性结局差异，而上游细胞触发因素和下游脊髓后果的整合尚不充分。两个核心问题悬而未决：第一，SNT中结构连续性的丧失如何重塑受损神经元的反应，使其从短暂激活（再生）状态转向慢性应激（退变）状态；第二，损伤方式和再生潜力的差异如何影响脊髓反应的性质和程度，可能揭示在局部修复成功时不太明显的潜在重组程序。
研究人员假设，不同的损伤模式（轴索断伤与神经断伤）触发不同的逆行信号级联反应，导致关键转录因子（如经典损伤标志物ATF3和神经发生相关因子MYCN）的差异时空表达。这些不同的特征不仅与局部再生反应相关，还与特定神经元亚群的命运和脊髓内的可塑性变化相关。
二、研究设计与主要发现
该研究在野生型、AdvCre;Ai14和MYCN-eGFP报告基因小鼠中开展了SNC与SNT的系统比较。纵向评估涵盖功能恢复、ATF3标记的神经元损伤反应、IB4阳性感觉神经元反应、脊髓背角小胶质细胞活化以及脊髓MYCN-eGFP信号。研究共使用120只小鼠，分为假手术组（n=36）、SNC组（n=42）和SNT组（n=42），每组雌雄各半。
主要发现包括：SNC与部分、测量指标特异性的功能恢复相关，表现为短暂且自限性的ATF3反应和有限的IB4阳性神经元轮廓减少；而SNT产生持续性的轴突断离相关神经元应激、IB4阳性神经元轮廓的减少和更持久的背角小胶质细胞活化。在POD7，两种损伤后脊髓腹角神经元中MYCN-eGFP强度均显著高于假手术水平且呈双侧升高，SNC后急性幅度最大。从POD7至POD14，SNC后MYCN-eGFP强度下降超过90%，而SNT后下降约60%，表明两种损伤方式存在不同的时间模式。
三、关键技术方法
该研究采用了多种关键技术方法。实验动物方面，使用了野生型C57BL/6J小鼠、AdvCre;Ai14报告基因小鼠（Advillin-Cre品系，JAX Stock No. 032536）和MYCN-eGFP转基因小鼠，均基于C57BL/6J背景。所有动物程序经中山大学机构动物护理和使用委员会批准（协议代码伦审动(Ref. 2023)365号，2024年1月4日批准）。行为学评估采用针刺试验（pinprick test）评估感觉功能，行走轨迹分析（walking track analysis）计算坐骨神经功能指数（sciatic functional index, SFI）、胫神经功能指数（tibial functional index, TFI）和腓神经功能指数（peroneal functional index, PFI）评估运动功能。组织学方面，使用Olympus FV3000共聚焦显微镜采集图像，通过免疫荧光染色检测ATF3、IB4、Iba1、NeuN、Cx3cr1、CD11b等标志物，并利用AdvCre;Ai14小鼠的内源性tdTomato荧光追踪感觉神经元轴突，MYCN-eGFP报告基因小鼠检测MYCN表达。统计分析使用GraphPad Prism 9.0，根据数据分布特征选择参数或非参数检验方法。
四、研究结果
4.1 SNC后轴突变性与再生的组织学证据
研究人员利用AdvCre;Ai14小鼠（其Advillin阳性外周感觉神经元被tdTomato组成性标记）结合髓鞘免疫荧光染色，在SNC后验证了轴突变性和再生的动态过程。POD7时，损伤近端神经的髓鞘纤维保持规则束状排列，tdTomato信号丰富且连续；压榨损伤部位髓鞘信号明显分散紊乱，正常束状结构完全消失，tdTomato信号显著减少，仅存少量碎片化轴突残留；损伤远端tdTomato信号几乎完全消失，直接证实轴突断裂后远端节段发生沃勒变性（Wallerian degeneration）。
4.2 SNC后部分功能恢复与SNT后持续性功能缺陷
SNC组感觉功能逐渐显著恢复，POD28时达到基线约60%；SNT组在整个28天观察期内完全且持续丧失感觉功能。运动功能方面，两组POD7均出现严重下降。POD28时SNC组PFI较POD14显著改善，且SNC显著优于SNT（p=0.0015）；TFI和SFI虽呈现SNC恢复更好的数值趋势，但未达统计学显著（TFI，p=0.238；SFI，p=0.070）。因此SNC运动恢复被描述为部分且指标特异性的，以PFI最为明显。
4.3 损伤方式决定DRG中神经元亚型特异性反应
ATF3作为神经元损伤和再生启动的经典标志物，在对侧未损伤DRG中几乎不存在。同侧DRG中，两种模型均在POD7达到ATF3表达峰值。但此后时间动态显著分化：SNC组ATF3表达快速下降，POD28恢复至接近基线水平，符合自限性再生程序；SNT组ATF3表达在POD14和POD28持续高于SNC，POD28达到统计学显著（p=0.0014），符合慢性神经元应激和靶标重连失败状态。IB4阳性非肽能伤害感受器方面，SNT诱导显著且快速的IB4阳性神经元轮廓减少，POD7降至基线约50%，POD28仅部分恢复至60%；SNC组各时间点仅显示最小且不显著的变化。Nissl/TUBB3共染色显示SNT后POD7同侧总DRG神经元群体密度和形态大致保持，提示IB4标记减少可能至少部分反映表型或凝集素结合变化而非神经元死亡。ATF3与IB4共染色显示两种标记标记的神经元群体基本不重叠，ATF3主要位于较大直径神经元，IB4位于较小直径神经元。
4.4 周围神经损伤诱导脊髓腹角神经元双侧MYCN-eGFP反应
MYCN-eGFP报告基因小鼠中，POD7时所有损伤/侧别组合的MYCN-eGFP强度均显著高于假手术基线：SNC同侧（255.7±10.3 AU）和对侧（122.7±23.2 AU）均显著高于假手术对侧（2.4±1.2 AU）；SNT同侧（80.2±7.9 AU）和对侧（62.2±16.8 AU）同样显著升高。这证实MYCN诱导是双侧的，且在两种损伤模型中均发生。急性（POD7）MYCN反应在SNC后数值和统计上均最大。至POD14，各损伤组MYCN强度均从POD7峰值显著下降，但下降幅度因损伤方式而异：SNC同侧下降90%，对侧下降92%；SNT同侧下降60%，对侧下降58%。MYCN-eGFP信号与同侧损伤脊髓中ATF3阳性神经元广泛共定位，但对侧未损伤神经元和同侧非ATF3表达神经元中的强MYCN信号表明其诱导不限于直接受损神经元。NeuN共染色确认MYCN-eGFP阳性细胞与大型多极NeuN阳性胞体共定位，形态和层板位置符合运动神经元特征，但NeuN是泛神经元标志物，不能像ChAT、Islet1/2或Hb9那样明确区分运动神经元亚型。
4.5 SNC和SNT后脊髓背角小胶质细胞活化
两种损伤在POD7和14均诱导同侧背角小胶质细胞活化。SNT组POD14的Iba1面积分数在数值上大于SNC，且多重比较校正后差异达统计学显著（p=0.0173），与SNT后更持久的小胶质细胞反应一致。Cx3cr1/CD11b共染色显示，SNT后POD7同侧背角小胶质细胞呈现更致密的Cx3cr1阳性/CD11b阳性细胞场，形态上分支减少、更呈阿米巴样，与向活化表型转变定性一致。
五、讨论与结论
讨论部分指出，该研究超越了单纯确认压榨损伤愈合更好的层面， delineated了区分两种损伤方式的细胞反应和脊髓特征差异。SNC模型以伴随成功再生的短暂自限性反应为特征，而SNT与持续性神经元应激、DRG中亚型特异性差异反应以及双侧脊髓MYCN反应相关，该反应的时间持续性（而非存在性）在两种损伤方式间存在差异，同时伴随背角小胶质细胞反应。
MYCN-eGFP在POD7时两种损伤中均呈双侧诱导，反驳了SNT独有的解释；急性幅度在SNC后实际上最大。这种双侧、损伤普遍的诱导模式与单侧周围神经损伤后对侧（“镜像”）脊髓变化的文献一致。研究人员提出对侧MYCN诱导可能反映神经元间通讯、经脊髓中间神经元回路的跨节段信号传导或稳态可塑性，但明确此为假说，因为未进行中间神经元特异性操作、示踪或候选连合通路损伤。
SNC中MYCN强度从POD7至POD14下降超过90%，而SNT仅下降约60%，因此SNT显示其自身较低幅度峰值的相对更大持续性。这些组内POD7与POD14比较显示每种损伤类型有其自身的时间轨迹，但未正式检验损伤×时间交互作用项，因此被谨慎描述为幅度和时间模式的数值性、描述性差异。
研究结论指出，SNC与短暂自限性DRG反应和相对保留的IB4阳性神经元标记相关，而SNT与持续性DRG应激、IB4阳性神经元轮廓的持续减少和更持久的背角小胶质细胞反应相关。脊髓中，两种损伤在POD7均引起腹角神经元MYCN-eGFP信号双侧增加，SNC后急性幅度更大，SNT后相对持续性更强。这些发现表明两种损伤方式产生重叠但在数量和时间上不同的细胞反应。双侧MYCN-eGFP反应可能代表对侧（“镜像”）脊髓反应，但其功能意义和潜在神经回路仍有待确定。总体而言，这些发现支持将SNC和未修复SNT用作再生许可性和持续性断离损伤的互补模型，并将双侧MYCN-eGFP动态变化确定为未来机制研究的候选细胞读数。使用运动神经元特异性标志物（ChAT、Islet1/2）确认腹角神经元身份、正式检验MYCN-eGFP反应的损伤×时间交互作用以及将行为评估扩展至疼痛特异性测量（von Frey、热、冷）仍是治疗外推前的重要优先事项。
