家族性1型糖尿病中反复出现的单CpG甲基化差异及其不完全分离

《Frontiers in Immunology》：Recurrent single-CpG methylation differences and incomplete segregation in familial type 1 diabetes

背景：1型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）在家族内聚集，但共享的遗传易感性并不能完全解释亲属间的发病不一致性。研究人员探究了单CpG甲基化差异是否在多重T1D家系中独立重复出现，以及这些位点的甲基化是否与T1D状态分离或与HLA II类风险单倍型剂量相关。方法：来自三个多重阿拉伯家系的17名参与者（包括9名T1D患者）接受了靶向亚硫酸盐测序。来自两次测序运行的数据被合并。每个家系均独立分析。未调整的家系内分析定义了跨家系重复集合，要求q<0.01、|Δβ|≥25%且在所有三个家系中方向一致；随后采用年龄和性别校正分析对重复候选位点进行优先级排序。候选位点接受了焦磷酸测序；公共T1D转录组数据集为注释基因提供了背景信息。HLA基因分型确定了风险单倍型剂量，供者水平模型在考虑家系结构的同时检验了与焦磷酸测序甲基化的关联。结果：未调整的家系内分析在三个家系中鉴定出22个甲基化方向一致的重复CpG位点。其中6个位点在年龄和性别校正后仍保留预设标准，并被优先纳入后续分析。这些位点定位至MYRIP、DLGAP2、ULK4、MTCL1、LINC00701和CCNG1。对MYRIP、ULK4和MTCL1的焦磷酸测序揭示了不同的甲基化分布，患病与未患病亲属占据重叠的状态或范围，与家系内不完全分离一致。HLA风险单倍型剂量在各家系中显示出T1D发生的梯度。在未调整的供者水平分析中，T1D参与者的MYRIP甲基化名义上较低，但未通过多重检验校正。在探索性校正供者水平模型中，较高的HLA风险剂量与较低的MYRIP甲基化相关。结论：这些发现鉴定出跨多重T1D家系重复出现的单CpG甲基化差异，但显示其与疾病在个体水平上的分离不完全。因此，这六个优先位点应被视为探索性甲基化候选位点，其与T1D的时间关系及可重复性需要在更大规模的独立纵向家系队列中评估。

家族性1型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）是一种免疫介导的胰岛β细胞破坏性疾病，其家族聚集现象显著，但共享的遗传易感性并不能完全解释亲属间的共患不一致性。HLA区域约占遗传易感性的50%，同卵双生一致性仅为35%至65%，多重家系中携带相同高风险HLA单倍型的同胞仍可出现不一致的疾病状态。既往甲基化研究多采用Illumina芯片平台，其覆盖范围偏向启动子和CpG岛，对增强子、shore等调控区域代表性不足，且以病例对照设计为主，难以直接检验某个甲基化状态是否在家系内与疾病共分离。针对这一空白，研究人员利用三个多重阿拉伯家系，试图鉴定能够独立跨家系重复出现的单CpG甲基化差异，并评估这些位点是否与T1D状态分离或与HLA II类风险单倍型剂量相关。

研究人员从科威特Dasman糖尿病研究所招募了A、B、C三个多重T1D家系共17名参与者，其中9例患有T1D，未患病亲属在入组时血糖正常。全部参与者接受了全外显子组测序，并采用HLA-HD推断HLA II类基因型；临床级Omixon分型用于验证。研究人员对同一索引文库进行了两次靶向亚硫酸盐测序（TruSeq Methyl Capture EPIC）并将两轮数据合并，以提高覆盖深度和可分析CpG数量。每个家系首先在无协变量条件下独立分析，定义未调整的跨家系重复集合，要求q<0.01、|Δβ|≥25%且三个家系方向一致；随后再加入年龄和性别进行校正，以优先筛选候选位点。对优先位点进行了焦磷酸测序，利用公共转录组数据集提供表达背景，并通过供者水平模型检验甲基化与疾病状态及HLA风险剂量的关联。

关键技术方法包括：靶向外显子组靶向亚硫酸盐测序合并两轮数据扩大CpG可分析范围；基于Bismark比对和methylKit逻辑回归框架的家系内差异甲基化分析；以q<0.01、|Δβ|≥25%及三系方向一致作为跨家系重复判定标准；焦磷酸测序作为正交验证；HLA-HD结合临床级分型确定风险单倍型剂量；E-MEXP-1140、GSE33440、GSE72492三个公共T1D转录组数据集用于基因表达背景分析。

合并两轮测序数据后，可分析CpG位点由首轮的85,922个扩大至630,081个，平均深度由10.6×增至19.0×。测序运行间一致性分析显示，两次运行在PC1至PC5上均无显著差异，层次聚类按样本而非按运行分组，提示无明显批次效应。基于571,676个可变常染色体CpG的主成分分析显示，家系成员在PC1-PC2投影上呈明显聚集，而T1D状态无清晰分离，提示家系结构是全局甲基化变异的主要来源。未调整的家系内分析在三个家系中鉴定出22个方向一致的重复CpG；年龄和性别校正后，6个位点保留预设标准，分别定位至MYRIP、DLGAP2、ULK4、MTCL1、LINC00701和CCNG1。覆盖度评估显示，合并后6个位点在所有家系均达到覆盖完整，而首轮单独分析仅MYRIP满足完整覆盖。基于坐标去重的敏感性分析未保留任何三系重复位点，但未出现甲基化方向反转。全队列九种敏感模型均保留这6个位点的显著性和方向。公共转录组分析显示，MYRIP、ULK4、MTCL1、CCNG1在E-MEXP-1140中差异表达，DLGAP2在GSE33440中差异表达，CCNG1在GSE72492中差异表达，但超几何检验未超过随机期望。焦磷酸测序显示MYRIP呈双峰分布（0-5%与41-49%）、ULK4呈三峰分布（0-4%、39-44%、75-78%），MTCL1呈连续分布（20-89%），患病与未患病亲属在各状态中均有重叠，提示家系内不完全分离。HLA分型临床级与外显子组推断在风险单倍型分类上完全一致；风险单倍型剂量为0、1、2的参与者中，T1D分别占0/2、3/8和6/7，呈梯度但非确定性。供者水平模型中，MYRIP甲基化在T1D中的名义降低未通过多重校正，而在完全调整模型中，较高HLA风险剂量与较低MYRIP甲基化显著相关（q=0.002），但该关联为模型依赖性探索性发现。

讨论部分指出，跨家系重复并不等于家系内确定性分离，6个优先位点应被视为探索性候选。MYRIP编码Rab27a效应器，参与胰岛素分泌颗粒锚定，具有β细胞功能相关性；ULK4、MTCL1、CCNG1等证据较间接。HLA风险剂量与疾病发生呈梯度关系，但个别个体即使携带纯合DR3-DQ2且甲基化状态与患病的单卵双胞胎相似，仍未发病，提示存在其他修饰因素。该研究的主要优势在于以家系为独立分析单位并纳入多种技术敏感性检验，主要局限包括队列规模小、PBMC混合细胞组成、单时间点采样以及焦磷酸测序仅在三分之二的优先位点获得可靠数据。研究结论为：共鉴定出22个跨家系重复的单CpG甲基化差异，其中6个位点经年龄和性别校正后优先，但个体水平分离不完全；这些位点属于探索性重复甲基化候选，其遗传和生物学基础、与T1D的时间关系以及可重复性需要在更大规模的独立纵向家系队列中进一步评估。