杨树叶际微生物群落多样性及其驱动因子研究

《Frontiers in Ecology and Evolution》：Study on phyllosphere microbial community diversity of poplar

　　

**摘要**

**引言：** 杨树是中国北方生态防护林和人工造林的核心树种，具有重要的生态和经济价值。定殖于叶片表面的叶际微生物在调节植物生长、抗病性和环境适应性方面发挥着关键作用。本研究旨在揭示不同杨树品种间叶际微生物群落的差异，并阐明叶片养分对微生物群落组装的驱动机制。

**方法：** 研究以辽宁省新民市的4个杂交杨树品种为对象，测定了叶片总碳、总氮、总磷、可溶性糖和淀粉含量，采用高通量测序技术鉴定叶际细菌和真菌的分类组成，分析品种间的多样性差异，并利用统计方法探究叶片养分与微生物群落之间的相关性。

**结果：** 4个杨树品种的叶片养分含量存在显著差异。叶际微生物优势类群整体稳定：真菌主要以子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为主，细菌主要以变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）为主。然而，不同品种间的物种丰富度和群落组成存在显著差异。相关性分析表明，叶片总氮和总磷是塑造叶际微生物群落组成的关键养分因子。

**讨论：** 本研究证实了不同杨树品种的叶际微生物群落具有明显的宿主特异性，叶片养分是调控群落结构的重要驱动因素。这些发现为人工杨树林的经营管理和微生物资源利用提供了科学依据。

**杨树叶际微生物群落多样性及其驱动因子研究——论文解读**

**一、研究背景与科学问题**

自工业革命以来，人类改造自然的强度不断加大，伴随社会经济发展水平的提升，出现了土壤侵蚀加剧、温室效应持续恶化、森林固碳能力逐渐下降等一系列生态问题。为应对这些挑战，生态植被的生态价值日益受到重视，其中杨树（*Populus × canadensis*）凭借适应性强、生长迅速等特点，成为中国“三北”防护林体系建设和人工造林的主要树种，承担着防风固沙、水土保持和生物多样性保护等国家战略功能。杨属（*Populus*）主要分为五个组，其中青杨组（Sect. Tacamahaca）物种数量最多，核心分布区集中于中国北方。杨树兼具极高的生态价值和经济价值，是造纸工业的重要原料来源。

植物可为内生和附生微生物群落提供多样化的生态位，微生物定殖于植物表面及内部组织，在养分吸收、促生、抗病和抗逆等方面发挥关键作用。定殖于植物叶片表面的微生物被称为叶际微生物（phyllosphere microorganisms），其总面积约为地球表面积的2倍，是一个重要的微生物生态系统。叶际微生物群落以细菌最为丰富，细菌密度可达10⁷–10⁸ CFU·cm^?2。从分类角度看，叶际细菌主要由变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）组成，其中变形菌门占据优势；叶际真菌以子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为主。植物叶际微生物群落的形成是一个多因素协同调控的复杂生态过程，且不同植物叶片生境会选择出不同的微生物类群，使叶际微生物表现出显著的宿主特异性。然而，在杂交杨树系统中，叶片养分性状与宿主遗传背景对叶际微生物群落组装的相对贡献尚不明确。为此，本研究选取辽宁新民地区种植的4个杂交杨树品种，开展叶际细菌和真菌群落多样性及驱动因子研究。

**二、研究内容与主要技术方法**

研究人员以辽宁省新民市4个杂交杨树品种（Y1: DM-9-18（*Populus deltoides*×*Populus maackii*）、Y2: DX-08-01（*Populus maximowiczii*×*Populus pseudosimonii*）、Y3: 2111（*Populus deltoides*×*Populus suaveolens*）、Y4: 9216（*Populus deltoides*×*Populus deltoides* cv. ‘Shanhaiguanensis’））为研究对象，每个品种设4个重复，共16个样方。采用超声辅助洗脱法提取叶际微生物，利用MiSeq高通量测序平台对16S rRNA基因V3-V4区（细菌）和ITS rRNA基因V1区（真菌）进行双端测序。同时采用元素分析仪和分光光度法测定叶片总碳（total carbon, TC）、总氮（total nitrogen, TN）、总磷（total phosphorus, TP）、可溶性糖和淀粉含量。数据分析主要运用QIIME2进行扩增子序列变异（amplicon sequence variant, ASV）划分和α多样性计算，基于Bray-Curtis距离进行非度量多维尺度分析（NMDS），利用LEfSe（Linear discriminant analysis Effect Size）筛选差异物种，通过Spearman相关分析和冗余分析（redundancy analysis, RDA）及方差分解分析（variance partitioning analysis, VPA）量化养分因子对微生物群落的影响。

**三、主要研究结果**

**3.1 叶片养分差异分析**

4种杨树叶片中总磷（F=44.60，p<0.0001）、总碳（F=6.82，p=0.0082）、总氮（F=340.38，p<0.0001）、淀粉（F=3.80，p=0.0481）含量存在显著差异，而可溶性糖含量无显著差异。Y3的TC、TN、TP和淀粉含量均为最高，分别为500.11 mg/g、34.08 mg/g、4.68 mg/g和29.21 mg/g；Y1的TN和TP最低（17.96 mg/g和1.42 mg/g），且C/N比最高（26.76）。表明Y3具有较强的光合代谢和养分吸收能力，而Y1采取养分保守型策略。

**3.2 叶际微生物群落组成与ASV分析**

经质控和去噪后，细菌共获得12,681条高质量序列，真菌获得2,269条高质量序列。维恩图（Venn diagram）分析显示，细菌中Y1、Y2、Y3、Y4分别有2,445、1,834、3,056、3,903个特有ASV，四者共有264个ASV；真菌中特有ASV数分别为432、508、437、692，四者共有24个ASV。Y1和Y2共享ASV数量最多，而Y3和Y4共享ASV数最少，表明Y1与Y2的叶际微生物群落相似度较高，Y3与Y4差异较大。总体上，叶际细菌物种丰富度高于真菌。

**3.3 门水平和属水平群落组成差异**

在门水平，真菌群落中优势类群为子囊菌门和担子菌门，其中子囊菌门在Y1中相对丰度最高（97.81%），在Y2中最低（85.32%）；担子菌门在Y2中最高（9.64%），在Y1中最低（1.68%）。细菌群落以变形菌门和放线菌门为主，变形菌门在Y3中最高（79.3%），在Y2中最低（46.79%）；放线菌门在Y2中最高（42.72%），在Y3中最低（10.59%）。在属水平，真菌中Nothophoma为四品种共同优势属，在Y4中相对丰度最高（41.71%）；Cryptocline在Y3中最高（38.74%）。细菌中Methylobacterium-Methylorubrum在Y1中最高（27.18%），Sphingomonas在Y4中最高（17.71%），Curtobacterium在Y2中最高（33.49%）。

**3.4 LEfSe差异物种筛选**

LEfSe分析显示，真菌门水平上子囊菌门主要富集于Y1；属水平上Kondoa和PseudoCercospora富集于Y1，Cladosporium、Dissoconium、Epicoccum、Trichoderma和Pseudogymnoascus富集于Y2，Nigrospora、Phyllosticta和Diaporthe富集于Y3，Neosetophoma、Phaeosphaeria和Venturia富集于Y4。细菌门水平上，酸杆菌门（Acidobacteriota）富集于Y3，放线菌门、绿弯菌门（Chloroflexi）和异常球菌门（Deinococcota）富集于Y2，拟杆菌门、粘球菌门（Myxococcota）和变形菌门富集于Y4，蛭弧菌门（Bdellovibrionota）富集于Y1；属水平上，Pseudomonas和Rosenbergiella富集于Y1，Methylobacterium-Methylorubrum和Hymenobacter富集于Y2，Acinetobacter和Sphingomonas富集于Y3，Pantoea富集于Y4。

**3.5 α多样性分析**

所有样品Good’s coverage≥0.9996，测序深度充分。真菌群落Chao1指数在Y2组显著高于Y1组（p=0.0074），Y2真菌物种丰富度最高，Y1最低；Shannon指数在四个品种间无显著差异（p=0.52）。细菌群落Chao1指数在Y4组显著高于Y2组（p=0.041），Y4细菌丰富度最高；Shannon指数无显著差异（p=0.13）。结果表明，品种差异主要影响物种丰富度，而对群落均匀度和整体多样性影响不显著。

**3.6 β多样性分析**

非度量多维尺度分析（NMDS）显示，真菌群落应力值（Stress）为0.0805，细菌群落为0.0758，均小于0.2，排序结果可靠。真菌群落中Y1与Y2聚于NMDS1负侧，Y3与Y4聚于正侧，两组完全分离，真菌群落β多样性差异显著。细菌群落中Y1与Y2均位于NMDS1正侧且距离较近，Y3集中于负侧，与Y1、Y2明显分离，Y4分布于中间偏右区域，表明不同杨树品种对叶际细菌β多样性亦有显著影响。

**3.7 叶际微生物群落与叶片养分相关性**

Spearman相关分析显示，真菌门水平上子囊菌门与淀粉含量呈强正相关，担子菌门与TP和TN呈正相关。属水平上Cryptocline、Rhodotorula和Nigrospora与TP、TN和TC显著正相关；Acremonium与淀粉显著正相关，Cladosporium与淀粉显著负相关。细菌门水平上Bacteroidota、Bdellovibrionota和Abditibacteriota与TP显著负相关，Bdellovibrionota和Abditibacteriota与TN显著负相关，Deinococcota和Bdellovibrionota与TC显著负相关。属水平上Methylobacterium-Methylorubrum与TP、TN、TC显著负相关，Hymenobacter与TP显著负相关，Rosenbergiella与TP、TN、TC显著正相关。

**3.8 α多样性指数与养分相关及RDA/VPA分析**

真菌群落中，淀粉含量与Chao1和Observed species指数显著负相关，TP、可溶性糖、TN、TC与Pielou_e均匀度指数显著正相关。细菌群落中，TP与Simpson指数显著负相关，对Pielou_e和Shannon指数亦有负面影响。冗余分析（RDA）显示，细菌群落全局模型显著（F=2.595，p=0.004，校正R2=34.72%），真菌群落亦显著（F=3.637，p=0.001，校正R2=46.78%）。方差分解分析（VPA）表明，大量元素（TC、TN、TP）独立解释细菌群落变异的30.79%和真菌群落变异的52.73%，而碳水化合物（可溶性糖和淀粉）独立解释仅1.47%和接近0%。单个养分中TN边际解释力最高（细菌34.85%，真菌52.23%），其次为TP和TC，可溶性糖和淀粉独立效应可忽略。但因TC、TN、TP之间存在强共线性，任何单一养分在边际检验中均未达显著，表明大量元素共同而非单独驱动叶际群落组装。

**四、讨论与结论总结**

讨论部分指出，宿主基因型是塑造叶际微生物组的重要过滤器。在相同立地条件下，4个杂交杨树品种叶片养分谱和叶际微生物群落结构均表现出明显分化，证实宿主介导的养分过滤在品种水平上发挥作用，即使环境微生物来源一致。Y3较高的TC、TN、TP和淀粉含量反映其更强的光合代谢和养分同化能力，而Y1的低氮低碳高C/N比体现养分保守策略。养分异质性形成不同微生境，选择出分类和功能迥异的微生物集合。淀粉与真菌物种丰富度的显著负相关可能反映碳泌出减少或渗透条件改变限制了真菌定殖；大量元素促进真菌均匀度则通过缓解竞争排斥实现。细菌中TP与Simpson指数负相关表明过量磷可能通过支持少数磷响应优势类群降低群落均匀度。TN和TP是构建叶际微生物群落的主要养分因子，该结果支持氮磷可利用性作为养分限制生境中微生物群落组装主要自下而上调控因子的范式。

研究结论归纳如下：叶片养分方面，Y3的TP、可溶性糖和淀粉含量较高，TC和TN亦最高，表明其光合代谢、渗透调节及养分吸收能力更强。α多样性分析显示品种差异显著影响叶际微生物物种丰富度但未显著改变整体多样性：真菌Chao1指数Y2最高、Y1最低（p=0.0074），细菌Chao1指数Y4最高、Y2最低（p=0.041），而Shannon指数均无显著差异；真菌和细菌丰富度格局相反，提示两个微生物界对宿主叶片环境的不同方面作出响应。群落组成方面，4个品种叶际真菌以子囊菌门和担子菌门为主，细菌以变形菌门和放线菌门为主，但优势门相对丰度存在明显品种间差异，表明宿主身份定量重塑了保守的核心叶际微生物组。相关分析表明TP、TN、可溶性糖和淀粉均对叶际微生物群落产生显著影响，其中TP和TN对群落组成的影响最为突出。