《Molecular Biomedicine》：mRNA lipid nanoparticle vaccines: current status, challenges and future prospects
信使RNA（mRNA）疫苗已成为经过临床验证的疫苗平台，这已由Comirnaty和Spikevax等新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫苗的成功所证明，其优势在于快速设计、生产可扩展性以及诱导原位抗原表达的能力。这一成功的关键因素是脂质纳米颗粒（LNP）递送系统，它可保护mRNA免于降解，并促进高效的细胞摄取和胞质递送，从而充分发挥mRNA技术的潜力。mRNA-LNP疫苗的持续发展需要对mRNA设计、LNP组成和递送策略进行整合优化，以实现更高的稳定性、高效的胞内递送和平衡的免疫应答。尽管取得了显著进展，但与制剂稳定性、长期储存稳定性、安全性和反应原性担忧以及免疫保护持久性相关的挑战仍阻碍着mRNA-LNP疫苗平台的更广泛应用。本综述整合概述了mRNA-LNP疫苗的最新进展，涵盖mRNA分子工程、LNP组成与递送机制、免疫应答、临床进展以及当前开发挑战。此外，还讨论了新兴策略，包括热稳定制剂、具有改善靶向能力的下一代LNP、新兴RNA平台以及人工智能辅助的RNA序列和脂质材料优化。通过总结当前成就和未来机遇，本综述强调了指导更安全、更稳定、更精准的mRNA-LNP疫苗平台理性设计的关键原则，并为加速其临床转化提供了见解。
**组成与作用机制（Composition and mechanism of mRNA-LNP vaccines）**
**mRNA组分（The mRNA component）**
mRNA疫苗依赖体外转录（IVT）合成的mRNA，其分子包含5'帽、5'非翻译区（UTR）、开放阅读框（ORF）、3'UTR和poly(A)尾。5'帽通过三磷酸桥连接鸟嘌呤核苷酸，并进行N7和2'-O-甲基化修饰，可保护mRNA免受外切酶降解，促进核输出并增强翻译起始效率。常用的帽类似物包括Cap 0、Cap 1、Cap 2、抗反向帽类似物（ARCA）及β-硫代ARCA。UTR区域调控mRNA稳定性与翻译效率，其中来源于人α/β-珠蛋白的UTR及双β-珠蛋白重复序列（2hBg）能显著增强蛋白表达。ORF决定抗原蛋白序列，密码子优化及修饰核苷酸（如N1-甲基假尿苷）可提高翻译并降低固有免疫激活。poly(A)尾通过与poly(A)结合蛋白（PABP）互作促进翻译，长度通常≥30–40个腺苷，也可采用分段或化学修饰结构以优化稳定性和表达时程。
**mRNA架构（mRNA architecture）**
非复制型mRNA仅编码抗原，结构相对简单，但需要较高剂量或全面优化以诱导有效免疫。自扩增RNA（saRNA）在编码抗原之外还包含源自甲病毒的复制酶组分（nsP1-4），可实现胞内自我扩增，显著降低有效剂量并延长抗原表达，但长链结构及双链RNA中间体可能引发固有免疫激活，需要通过序列修饰或拆分复制酶等方法缓解。环状RNA（circRNA）通过共价闭合结构抵抗外切酶降解，采用内部核糖体进入位点（IRES）驱动翻译，具有更高的稳定性和更长的蛋白表达半衰期；冻干circRNA-LNP制剂在4°C下可维持免疫原性达24周，但环化效率和规模化生产仍是挑战。
**LNP递送系统（The LNP delivery system）**
LNP通常由可电离脂质、胆固醇、磷脂和聚乙二醇（PEG）-脂质组成，粒径约100 nm。可电离脂质（如SM-102和ALC-0315）具有pH依赖性电荷切换能力，通过胺头、连接链和疏水尾调控pKa、稳定性和内体逃逸。磷脂（如DSPC、DOPE）维持双层结构并调节膜融合；胆固醇增强膜完整性和循环半衰期；PEG-脂质（如DMG-PEG2000）提供空间位阻，防止聚集并提高胶体稳定性。LNP通过微流体混合等方法自组装，并可通过组分比例优化实现靶向递送。
**作用机制：从注射到免疫应答（Mechanism of action: from injection to immune response）**
mRNA-LNP疫苗经肌内注射后，可转染局部肌肉细胞和常驻抗原提呈细胞（APC），部分颗粒经淋巴循环进入淋巴结。RNA感应受体（如内涵体TLR3/7、胞质RIG-I、MDA5等）及脂质感应受体TLR4激活NF-κB/IRF信号，产生Ⅰ型干扰素和促炎细胞因子，而过度固有感应可能抑制翻译。抗原蛋白经蛋白酶体降解后，通过MHC Ⅰ类途径呈递至CD8
+ T细胞，同时也可经MHC Ⅱ类途径激活CD4
+ T细胞，并诱导B细胞分化和体液免疫应答。
**现状与临床成功（Current status and clinical success）**
**COVID-19疫苗（COVID-19 vaccines）**
目前已有八种LNP-mRNA疫苗获批用于人类，其中七种针对COVID-19，一种针对呼吸道合胞病毒（RSV）。Comirnaty
?（BNT162b2）和Spikevax
?（mRNA-1273）是首批获得紧急使用授权并广泛接种的疫苗，其LNP组成和剂量不同。全球超过十亿剂次的接种数据证实其预防重症和死亡的高效性与良好安全性，但体液和细胞免疫随时间衰减，且肌内注射不能诱导黏膜免疫。针对变异株已开发二价疫苗和改良制剂，如mRNA-1283（仅编码RBD和NTD）在2–8°C下稳定性更高；中国和日本等地的国产疫苗（如SYS6006、DAICHIRONA
?、AWcorna）亦获批，进一步丰富了全球供应。
**临床开发中的疫苗（Vaccines in clinical development）**
2024年FDA批准Moderna的mRNA-1345（mRESVIA
?）用于预防≥60岁成人的RSV相关下呼吸道疾病，这是首个非SARS-CoV-2的mRNA-LNP疫苗。针对猴痘病毒（MPXV）的多表位mRNA疫苗可诱导高滴度中和抗体和T细胞应答；针对寨卡病毒（ZIKV）的mRNA-1325和mRNA-1893已进入Ⅰ期临床并显示持久中和抗体；流感mRNA疫苗（如mRNA-1010）能产生优于传统灭活疫苗的血凝抑制效价；狂犬病mRNA疫苗（CV7201/CV7202）在低剂量下达到WHO标准；HIV疫苗（mRNA-1644、mRNA-1574等）则通过种系靶向和病毒样颗粒策略探索诱导广谱中和抗体的可行性。
**关键挑战与优化策略（Key challenges and optimization strategies）**
**稳定性与冷链运输（Stability and the cold chain transportation）**
mRNA-LNP疫苗目前高度依赖冷链储存，如BNT162b2需?90°C至?60°C，mRNA-1273需?50°C至?15°C，且货架期仅10–12个月，严重限制了资源匮乏地区的可及性。稳定性受mRNA化学降解（水解、氧化）和LNP物理不稳定（聚集、融合、mRNA泄漏）共同影响。
**影响mRNA疫苗稳定性的因素（Factors affecting the stability of mRNA vaccines）**
**LNP组分的影响（Impact of LNP components）**
可电离脂质的酯键水解和烷基链氧化会破坏制剂完整性；胆固醇的摩尔比例显著影响颗粒稳定性，过低或过高均不利；PEG-脂质的聚环氧乙烷醚键易受自由基氧化产生醛类杂质，可能与mRNA碱基反应；磷脂的不饱和链易氧化生成亲电产物，导致mRNA交联。
**制剂工艺的影响（Impact of formulation process）**
LNP粒径需控制在50–150 nm以保持物理稳定性；表面电荷受pH影响，酸性条件下可电离脂质质子化增强静电排斥；残留乙醇（<0.5% v/v）和柠檬酸盐缓冲液可导致脂膜融合、聚集或mRNA降解。微流体混合和冲击射流混合（IJM）可实现可控粒径和批次一致性。
**储存与运输（Storage and transportation）**
温度升高会加速脂质氧化和mRNA降解，振动、剪切及反复冻融可能导致LNP聚集或破裂。研究显示，含有合适冻干保护剂（如蔗糖、海藻糖）的制剂可在2–8°C维持关键质量属性。
**LNP稳定性关键组分的优化（Optimization of key components of LNP stability）**
设计含哌啶基团的可电离脂质可限制醛类杂质生成；分支烷基尾链能增加制剂微黏度（>150 mPa·s），在40°C下保持粒径和包封率稳定。胆固醇类似物（如Hchol）通过组氨酸酰胺基团增强内体逃逸和膜稳定性。缓冲液选择至关重要，三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）缓冲液在冷冻时pH波动小，并能捕获醛基杂质；而磷酸盐缓冲液（PBS）在冻融时易发生相分离。糖类稳定剂通过玻璃化或氢键替代机制保护LNP，但浓度过高会降低转染效率。精确控制制备和储存过程中的pH及乙醇残留量是保证制剂稳定性的关键。
**安全性与反应原性特征（Safety and reactogenicity profile）**
**临床反应原性与不良事件（Clinical reactogenicity and adverse events of mRNA-LNP vaccines）**
mRNA疫苗常见局部和全身反应（疼痛、发热、疲乏等），严重不良事件（如心肌炎）罕见。反应原性主要源于mRNA激活固有免疫通路，释放TNF-α、IL-6等细胞因子。
**改善安全性的机制决定因素与制剂策略（Mechanistic determinants and formulation strategies to improve safety）**
通过改变PEG-脂质链长和比例、采用无针注射器递送裸mRNA、以聚肌氨酸（pSar）替代PEG化脂质、使用维生素B5衍生的可电离脂质等策略，可降低反应原性和靶外毒性。可电离脂质的代谢物（如脂肪酸）可能通过激活PPAR导致肝损伤，抗PEG抗体则增加过敏风险。
**免疫应答持久性（Durability of immune response）**
**增强免疫原性与免疫记忆以维持持久保护（Enhancing immunogenicity and immune memory to sustain durable protection）**
佐剂（如TLR激动剂）和细菌外膜囊泡包被的LNP（OMV-LNP）可增强生发中心B细胞和记忆B细胞形成，延长中和抗体持续时间。PEG-脂质比例和磷脂类型影响抗体质量，如LNP H（0.5% PEG、DSPC）诱导更强的体液免疫和长期骨髓浆细胞应答。
**长期免疫原性、安全性与未来研究重点（Long-term immunogenicity, safety concerns, and future research priorities）**
目前对LNP长期免疫原性和重复给药后的慢性效应认知有限，补体激活相关的假性过敏（CARPA）和自身免疫风险仍需深入研究。
**未来前景与新兴创新（Future prospects and emerging innovations）**
**mRNA序列工程与递送平台优化（Optimization of mRNA sequence engineering and delivery platforms）**
冻干技术是实现常温储存的重要方向。研究显示，在Tris-蔗糖-麦芽糖缓冲液中制备的mRNA-LNP可在室温稳定12周，4°C稳定24周；Moderna的巨细胞病毒疫苗mRNA-1647冻干制剂可在5°C保存18个月。新型干燥技术（喷雾干燥、薄膜冷冻干燥等）也在探索中。人工智能被用于预测RNA降解率、优化mRNA二级结构（如LinearDesign算法），从而提高抗原表达和免疫原性。
**推进免疫激活与佐剂策略的机制理解（Advancing mechanistic understanding of immune activation and adjuvant strategies）**
免疫信息学可构建多表位mRNA疫苗以覆盖不同病毒属；选择性器官靶向（SORT）策略通过在LNP中添加辅助脂质（如DOTAP）改变ApoE结合，实现肺、脾等器官靶向。配体修饰（如甘露糖、RGD肽）可提高抗原提呈细胞特异性摄取。
**人工智能与高通量方法用于抗原发现和载体优化（AI-enabled and high-throughput approaches for antigen discovery and vector optimization）**
AlphaFold等结构预测工具辅助抗原表位选择；高通量组合化学结合机器学习（如AGILE平台）可快速筛选和设计新型可电离脂质。多模态模型和空间转录组学有助于理解LNP在组织中的分布，器官芯片为体外筛选提供仿生平台。
**应用领域扩展与个性化免疫治疗推进（Expansion of application domains and advancement of personalized immunotherapy）**
基于全外显子测序预测新生抗原，LNP递送mRNA编码的肿瘤新抗原可激活CD8
+ T细胞清除肿瘤。LNP平台正从疫苗载体扩展至癌症免疫治疗、自身免疫疾病和基因编辑（CRISPR/Cas9）。针对细菌和寄生虫的mRNA疫苗已进入临床，真菌靶点仍是空白。将TLR7激动剂嵌入脂质结构形成五组分LNP可在降低剂量的同时增强免疫应答，有利于多价疫苗开发。
**结论（Conclusions）**
本综述通过整合序列工程、脂质纳米颗粒、制造与监管证据，提出：在临床可行性已确立的背景下，稳定性与可及性仍是全球部署的关键制约因素。联合优化RNA序列和脂质组分，配合冻干耐受且减少冷链依赖的工艺改进，为实现热稳定和低剂量下一代产品提供了清晰技术路径。同时，在标准化指标与真实世界数据协调一致的评估框架下，需系统评价免疫保护持久性和安全性；结合saRNA、circRNA等新兴RNA格式和含佐剂LNP，人工智能将序列设计、脂质筛选和工艺参数纳入统一数据框架，借助可解释的多尺度模型和主动实验设计，可缩短优化周期并加速临床转化，同时扩大全球可及性。
