淀粉样Aβ42肽第34位拴联的准稳定毒性二聚体的生物物理与结构表征

《npj Dementia》：Biophysical and structural characterisation of a quasi-stable toxic dimer of amyloid Aβ42 peptide tethered at position 34

　　

非纤维状寡聚形式的淀粉样β（Aβ）在阿尔茨海默病（AD）中介导毒性，其中Aβ的累积先于tau聚集和突触损伤。研究人员认为Aβ寡聚化起始于最小的稳定单元——二聚体，然而由于该物种的瞬态性质，其结构细节仍不清楚。在此，研究人员合成了一个准稳定的E22P,L34DAZ-Aβ42二聚体，该二聚体在残基22–23处引入“毒性转角”，并在L34处引入柔性DAZ（l,l-2,8-二氨基壬二酸）连接子；基于研究人员的晶体学数据，L34是Aβ42二聚体和四聚体界面中的关键残基。硫黄素-T（ThT）实验、透射电子显微镜（TEM）、圆二色光谱（CD）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）表明，该二聚体形成非纤维状聚集体，主要为四聚体（约16%）和十二聚体（约77%），这一点已通过小角X射线散射（SAXS）证实。基于Aβ晶体结构的SAXS建模提示，这些聚集体为紧凑、折叠的β-发夹寡聚体，保留残基22–23处的“毒性转角”，并组装成球状非纤维状聚集体。该二聚体寡聚体在低纳摩尔浓度下对THP-1细胞表现出细胞毒性。

**论文解读：基于第34位拴联的准稳定Aβ42毒性二聚体的生物物理与结构特征**

**一、研究背景与科学问题**
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是最常见的痴呆类型，其病理特征包括淀粉样β（amyloid β, Aβ）蛋白斑块和由磷酸化tau蛋白构成的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）。目前尚无分子层面的解释能够阐明斑块与缠结如何在AD中共同累积。越来越多的证据表明，非纤维状寡聚形式的Aβ在AD中介导毒性，且Aβ累积先于tau聚集，随后引发突触变性。然而，近年来的结构研究与抗体疗法主要聚焦于Aβ的纤维状或前纤维状聚集体，对其非纤维状寡聚聚集体的关注不足，限制了对AD诊断和治疗方法的开发。

可溶性Aβ寡聚体可形成从二聚体、四聚体到十二聚体（或Aβ*56样，约56 kDa，约12聚体）及更大物种的组装体，其细胞毒性与尺寸呈负相关，即较小寡聚体比较大规模更具毒性。Aβ寡聚化被认为经由最小的稳定单元——二聚体起始，该二聚体由两个折叠的单体自我缔合而成。后续寡聚化可能并非简单的单体添加，二次成核事件（如二聚体-二聚体缔合形成四聚体）也可能发生。因此，Aβ二聚体单元被视为形成毒性聚集体（toxic aggregates）的关键构件。Aβ二聚体已在脑脊液中被检测到，并从AD脑中分离，但其结构信息仍然有限。由于这些寡聚体天然不稳定且易于进一步聚集，化学修饰引入构象约束可帮助稳定特定寡聚物种，从而实现其结构表征。

**二、研究目的与设计思路**
为探究L34残基在Aβ42寡聚体中的构象作用，研究人员合成了一种在L34位点通过l,l-2,8-二氨基壬二酸（DAZ）连接子连接的准稳定二聚体（E22P,L34DAZ-Aβ42二聚体）。该构建体还包含E22P突变，该突变能够稳定“毒性转角”（toxic turn），并已被证明可加速毒性淀粉样聚集体的形成。研究人员基于Aβ18–41四聚体核心和Aβ1–16 N端片段的晶体结构，构建了寡聚物种的三维原子模型。通过小角X射线散射（SAXS）、透射电子显微镜（TEM）、圆二色光谱（CD）、电喷雾电离质谱（ESI-MS）以及硫黄素-T（ThT）实验和细胞毒性评估，对第34位拴联的Aβ42准稳定二聚体进行了生物物理和结构表征。

**三、主要结论**
研究得出以下结论：
1. SAXS分析显示，E22P,L34DAZ-Aβ42二聚体主要形成四聚体（约16%）和十二聚体（约77%），另有少量二聚体（约1.6%）和八聚体（约4.9%）贡献。Kratky图和P(r)函数表明该聚集体为折叠的球状组装体，且不发生广泛聚集。
2. ThT实验证实，该二聚体在24小时内不形成ThT阳性的纤维状聚集体，不具备朊病毒样播种活性，反而能以10:1摩尔比抑制野生型Aβ42的聚集。
3. TEM显示，该二聚体在24小时孵育后主要形成球状颗粒，平均直径约3.9 nm；在48小时后出现极低丰度的类原纤维组装体，平均厚度约6.5 nm，但缺乏典型的交叉β-折叠结构。
4. CD光谱表明，该二聚体在长达48小时孵育期间不出现β-折叠富集结构特有的约220 nm负峰，说明其未采用典型的交叉β-折叠纤维构象。
5. ESI-MS检测到与二聚体、四聚体及更高阶物种相关的峰，与SAXS结果一致，但非纳米电喷雾电离（non-nano-ESI）仪器的灵敏度限制了m/z大于3000的峰强度。
6. 细胞毒性实验显示，该二聚体在低纳摩尔浓度下对THP-1细胞（小胶质细胞样）表现出强细胞毒性，但对SH-SY5Y细胞（神经元样）几乎无毒性；相比之下，WT-Aβ42和E22P-Aβ42对SH-SY5Y细胞具有显著细胞毒性。这表明Aβ毒性机制在不同细胞类型中存在差异，成熟ThT阳性纤维可能对神经元样细胞毒性更为关键，而非纤维状寡聚体则选择性作用于小胶质细胞样细胞。

**四、关键技术与方法**
研究人员合成了双Fmoc保护的DAZ连接子，并在微波辅助固相肽合成中于L34位置引入该连接子，生成共价稳定的二聚体（纯度经HPLC验证，分子量经高分辨电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱（HR-ESI-qTOF-MS）确认）。SAXS测量在澳大利亚同步辐射装置SAXS/WAXS光束线上进行，数据经ATSAS和SASView软件处理，包括Guinier分析、Kratky图、P(r)函数、BODIES形状建模、DAMMIF/DAMIN ab initio建模以及基于晶体结构的混合寡聚体拟合。同时采用了ThT荧光实验、负染色TEM成像、CD光谱、ESI-MS（Bruker timsTOF，负离子模式）以及MTT法评价细胞毒性。样本来源：THP-1细胞（美国典型培养物保藏中心，TIB-202）经TPA诱导分化为巨噬细胞样表型；SH-SY5Y细胞用于神经元模型。

**五、结果分述**
**SAXS揭示E22P,L34DAZ-Aβ42二聚体主要形成四聚体和十二聚体**
SAXS测量的可用q范围为0.013–0.378 ??1。低q区平滑，无典型Aβ42聚集的陡峭上升，表明溶液中的二聚体未发生广泛聚集。Kratky图呈钟形峰，提示折叠球状组装。Guinier分析得到平均回旋半径（Rg）为24.54 ?（ATSAS）和24.56 ?（SASView）。实验强度随角度衰减较慢，表明存在细长结构。BODIES模型拟合偏好椭球体，尺寸约43×31×15 ?；SASView核-壳椭球拟合给出最佳约化χ2=0.231（χ2/Npts）或1.848（Nind×χ2/Npts）。DAMMIF/DAMIN ab initio模型获得约75×57×33 ?的“细长椭球”形状。随后，基于Aβ18–41四聚体晶体结构和Aβ1–16片段构建二聚体、四聚体、八聚体、十二聚体和十六聚体模型（含紧凑和扩展两种N端构象），使用ATSAS OLIGOMER和SASView DREAM算法进行混合寡聚体拟合，最终确定约77%信号来自十二聚体，16.4%来自四聚体，并给出各物种平均直径：二聚体31.4 ?、四聚体47.0 ?、八聚体56.3 ?、十二聚体65.2 ?。

**ThT实验表明非纤维状寡聚化**
ThT荧光动力学显示，E22P-Aβ42在4小时达到最大荧光，WT-Aβ42在8小时达到峰值，而E22P,L34DAZ-Aβ42二聚体在24小时内无显著荧光，说明不形成ThT阳性纤维。播种实验表明该二聚体不具有朊病毒样播种活性，反而能以10:1摩尔比抑制WT-Aβ42的聚集速率，提示其可能以“非生产性”途径结合聚集中间体从而阻断纤维形成。

**TEM分析二聚体聚集体形态**
负染色TEM显示，E22P,L34DAZ-Aβ42二聚体在24小时孵育后主要形成球状颗粒，尺寸分布约3–5 nm，平均直径3.9 nm。相比之下，WT-Aβ42形成典型的扭曲纤维，平均厚度8.5 nm。在48小时延长孵育后，偶见类原纤维线状组装体，平均厚度6.5 nm，无扭曲，且ThT检测不到交叉β结构，可能是寡聚体沿疏水界面堆叠的产物。

**CD分析显示缺乏β-折叠富集结构**
CD光谱中，WT-Aβ42在0小时呈约200 nm负峰（无规卷曲），4小时后转变为约200 nm正峰和约220 nm负峰，符合β-折叠纤维形成特征；E22P-Aβ42也出现类似变化。而E22P,L34DAZ-Aβ42二聚体即使在48小时后仍无约220 nm负峰，表明其不形成典型交叉β-折叠纤维结构，维持非纤维状构象。

**ESI-MS测量组装寡聚体**
非纳升ESI-MS仅能可靠识别m/z 2972.2和2547.6的峰（对应二聚体和四聚体衍生物种），在m/z 4481.1和4132.4处有弱宽峰，接近理论值4456.2和4113.4，可能对应四聚体、十二聚体及更高阶物种的多种电荷态，且存在峰重叠。结果与SAXS推断的四聚体和十二聚体主导一致。

**THP-1细胞选择毒性**
MTT实验表明，E22P,L34DAZ-Aβ42二聚体在低纳摩尔浓度下对THP-1细胞具有强细胞毒性，而对SH-SY5Y细胞几乎无毒性。WT-Aβ42和E22P-Aβ42则对SH-SY5Y细胞显著毒性。研究人员认为，Aβ寡聚体可能通过插入细胞膜、形成孔道或干扰膜通透性来杀伤小胶质细胞样细胞，而神经元样细胞的毒性可能更依赖于成熟纤维或二次成核过程。

**六、讨论与结论**
讨论部分指出，基于SAXS结果与晶体结构的一致性，E22P,L34DAZ-Aβ42二聚体形成紧凑、折叠的β-发夹寡聚体，其尺寸（3.1–6.5 nm）与既往报道的3.85 nm寡聚体、冷冻电镜和原子力显微镜观察到的2.8 nm及5.5–5.6 nm物种吻合。该模型揭示了Aβ寡聚化中二聚体到四聚体以及更高阶组装的保守界面（特别是L34在二聚体/四聚体界面中的核心作用），并支持了“毒性转角”（E22-D23转角）在非纤维状毒性寡聚体中的保留。

对于毒性选择性，研究人员提出小胶质细胞膜具有更高流动性和不同脂质组成，更易被非纤维状寡聚体破坏；此外，小胶质细胞通过吞噬作用内化Aβ，细胞内Aβ主要以非纤维状寡聚形式存在，这与THP-1细胞的高敏感性一致。研究还指出，Aβ*56（约56 kDa的十二聚体）虽未采用平行的规则β-折叠纤维结构，但可与其尺寸匹配。这些发现提示，针对小胶质细胞特异毒性Aβ寡聚体构象的干预策略可能具有治疗潜力。

**研究结论**
研究人员合成并表征了一种在L34位点通过DAZ连接子拴联的准稳定毒性Aβ42二聚体模型。该模型表现出与AD中观察到的非纤维状Aβ寡聚体一致的结构和生物物理特征，保留了参与Aβ折叠和寡聚化的关键残基和基序（特别是“毒性转角”和L34介导的疏水界面），为研究AD中非纤维状寡聚体的形成提供了合理的框架。该二聚体对THP-1小胶质细胞样细胞具有强选择性毒性，提示形成特异性的小胶质细胞毒性Aβ寡聚体可能是AD发病的关键事件，鉴定该淀粉样结构可作为潜在治疗靶点。