《Australasian Plant Pathology》：Intraspecific variability among Pratylenchus brachyurus: insights from an integrative taxonomy approach
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短体线虫（Pratylenchus brachyurus）在形态和遗传组成上均表现出显著的种内变异，对巴西多种作物（包括咖啡和棉花）造成严重危害。本研究通过对来源于不同地理区域、最初采集自咖啡田和棉田的P. brachyurus种群进行形态测
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短体线虫（Pratylenchus brachyurus）在形态和遗传组成上均表现出显著的种内变异，对巴西多种作物（包括咖啡和棉花）造成严重危害。本研究通过对来源于不同地理区域、最初采集自咖啡田和棉田的P. brachyurus种群进行形态测量学（morphometric）和分子特征（molecular characterization）分析，以评估这些种群的遗传变异性。研究人员共评估了4个P. brachyurus种群：3个最初采样自圣保罗州（S?o Paulo state）咖啡田的种群（Dracena – PbDR，Franca – PbFR，Gar?a – PbGA）和1个最初采集自巴伊亚州（Bahia）棉田的种群（S?o Desidério – PbSD）。种内变异通过形态测量学研究以及ITS-1区域的分子分析来表征。形态测量学分析显示，PbDR、PbFR和PbSD种群之间较PbGA具有更大的相似性；而分子分析则突出了种群间的遗传变异，以及从单一PbGA雌虫获得的ITS-1克隆系（clones）所表现出的个体内变异性（intra-individual variability）。通过整合形态测量学与遗传学证据的整合分类学方法（integrative taxonomy approach），研究人员证明了P. brachyurus种群间存在种内变异。
论文解读文章：
一、研究背景与科学问题
巴西在全球农业舞台上占据突出地位，是咖啡（Coffea spp.）和棉花（Gossypium spp.）等大宗商品的主要生产国之一。然而，这些作物的产量可能受到植物寄生线虫（plant-parasitic nematodes）寄生危害的影响，尤其是根结线虫属（Meloidogyne）和短体线虫属（Pratylenchus）的线虫。在植物寄生线虫中，短体线虫（Pratylenchus brachyurus）是对咖啡和棉花植株危害最严重的物种之一。由于其多食性和迁移性行为，P. brachyurus种群在巴西迅速增加和扩散。然而，该物种造成的损害，尤其是在咖啡作物上的损害，仍被低估。
P. brachyurus的鉴定基本上基于经典分类学，即形态学特征。然而，由于该物种在形态/形态测量学、生物化学和遗传学方面存在种内变异性，这种鉴定可能具有挑战性。已有研究通过生物化学方法证明了这种变异性，同工酶电泳揭示了多个P. brachyurus种群间的种内分化和不同的表型特征。形态学变异性已在棉花上的根病线虫种群中被描述，最近，经典分类学和形态测量学分析也证明了来自咖啡植株的种群间存在这种变异性，揭示了形态测量性状的显著差异和不同的种群分组。尽管如此，与咖啡相关的P. brachyurus种群的种内变异性知识仍然有限。
在此背景下，分子技术已成为辅助线虫鉴定、比较物种内和物种间遗传内容、从而更好地理解其系统发育关系的重要替代方法。一些分类学家采用整合分类学方法鉴定生物体，该方法联合考虑不同性质的数据进行分析，将多种鉴定系统视为互补而非竞争或排他。尽管在分析特征上有所不同，但这些方法汇聚于同一目标，为获得的结果提供了更高的可靠性。
尽管P. brachyurus对咖啡和棉花造成严重危害，但考虑到寄主和地理来源、以辅助两种作物育种计划的线虫种群形态学和遗传学种内变异性研究仍然很少。对种内变异性的详细了解对于植物育种尤为重要，因为不同种群可能在形态和遗传特征上存在差异，从而影响其与寄主植物的相互作用。因此，开展本研究旨在通过形态测量学和分子特征分析，阐明不同地理和寄主来源的P. brachyurus种群间种内遗传变异性的本质。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员对4个P. brachyurus种群进行了分析：PbDR、PbFR和PbGA三种群分别采集自圣保罗州Dracena、Franca和Gar?a市的咖啡植株（Coffea arabica L.），第四种种群PbSD采集自巴伊亚州S?o Desidério市的棉花（Gossypium hirsutum L.）。所有种群在温室盆栽中于相似环境条件下同时以玉米（Zea mays）、黧豆（Mucuna pruriens）和棉花为寄主植物进行维持培养，维持时间分别为16年、5年、2年和2年。
研究采用的关键技术方法包括：（1）形态测量学表征：从感染寄主植物的根部提取30个雌虫个体，在光学显微镜下进行测量，基于13个测量变量和6个计算变量（对应De Man指数），共19个形态测量学变量进行表征；（2）DNA提取：采用改良的Holterman方法对单雌或雌虫混合样本进行DNA提取；（3）PCR扩增与测序：利用位于18S和ITS-1区域的引物18S和ACM7R扩增ITS-1区域，通过Sanger测序获取序列；（4）rDNA克隆：对低质量序列的PCR产物进行克隆（PGEM-T-easy Vector System I），转化Escherichia coli DH10B，以解析序列重叠问题；（5）系统发育分析：采用最大似然法（Maximum Likelihood method）构建系统发育树，并使用1000次自举重复；（6）统计分析：使用R软件进行方差分析（ANOVA）、Tukey HSD检验、主成分分析（PCA）和判别主成分分析（DAPC）。获得的序列已提交至GenBank数据库（登录号PX410056-PX410068）。
三、研究结果
（一）形态测量学特征
将本研究中评估的四个种群的形态测量学数据与Type种群（Godfrey 1929）进行比较，发现所有测量和计算变量均落在最初描述的范围内。四个P. brachyurus种群在Po、? bst和F变量的平均值上未观察到差异。PbDR、PbFR和PbSD种群的个体彼此之间表现出更大的相似性，其中68%（PbFR × PbSD和PbDR × PbSD）和74%（PbFR × PbDR）的测量变量平均值无显著差异。PbGA种群被证明更为疏远，尤其是与PbFR和PbDR相比，分别有11个和13个变量的平均值存在统计学显著差异。
主成分分析（PCA）显示，约50%的实验变异性在1/2平面上得到表征。与个体长度和直径相关的四个变量（? v、? c、? a 和 L）彼此紧密相关，且与PC1相关；而涉及尾部形态的变量T、c和c′与PC2显示出更强的相关性。PCA 1/2平面上的个体分布突出了PbDR和PbFR种群（主要位于PC1左侧）与PbGA个体（位于同一轴右侧）之间的差异。约90%的PbSD个体聚集在PC2的下部区域。观察到的离散度揭示了P. brachyurus种群内存在的种内变异性。
判别主成分分析（DAPC）同样有效地区分了P. brachyurus种群。PbDR和PbFR的个体在横轴左侧重叠为一个组，反映了这两个种群之间的密切相似性。PbSD和PbGA种群形成独立的簇，彼此之间或与其他种群之间均无重叠。DAPC推断的种群结构显示，60个被评估个体对其各自组的正确归属概率为91.67%。PbSD和PbGA种群相当同质，外来个体被归属到它们的概率较低，其中PbGA是组成个体间均匀性最高的种群。相反，PbDR和PbFR观察到较高的外来个体归属概率，表明这些是异质性最高的种群。
（二）分子特征
从P. brachyurus种群PbDR、PbFR、PbGA和PbSD中共获得13条ITS-1区域部分序列，包括PbDR一条、PbFR一条、PbGA九条（来自单一雌虫的克隆系）、PbSD两条序列。基于PCR扩增和测序的ITS-1片段构建系统发育树，最终树长度为365 bp。所有属于Pratylenchus属的种群形成了区别于外群R. similis的独立组群。尽管存在一定程度的遗传变异，PbDR、PbFR、PbGA和PbSD种群均被确认为P. brachyurus，因为它们与该物种其他从NCBI选择种群聚在同一进化枝中。
系统发育分析检测到PbGA种群单一雌虫克隆系间的个体内变异性，序列差异最高达16%。克隆系PbGA6被置于一个不同于其他克隆系的进化枝中，自举值为84%。值得注意的是，序列PbGA1、PbGA3、PbGA4、PbGA5、PbGA7和PbGA8与美国来源的序列（JN020926.1、JN020927.1、JN020928.1和FJ712900.1）聚为一组，而PbGA2和PbGA9序列则与中国来源的P. brachyurus序列（KF712470.1和KF712471.1）聚为一组。
补充系统发育分析，身份矩阵也证明了PbDR、PbFR、PbGA和PbSD种群间的种内变异性，序列相似性介于90%至100%之间。这些种内变异性值被认为是低的，即四个P. brachyurus种群的所有个体都表现出大致相似的遗传同一性。系统发育分析观察到的PbGA种群克隆系间个体内变异性显示序列相似性介于91%至100%之间。
四、讨论与结论
本研究中所有四个种群获得的形态测量学值均保持在物种先前报告的范围内，包括Type种群的范围内。尽管多个变量的形态测量学范围在种群间重叠，但这是P. brachyurus种内变异的预期模式，并不妨碍检测种群间的定量差异。观察到的平均值统计学显著差异不应被解释为分类学不连续性或物种分化的证据，而是P. brachyurus内形态测量学分化的指示。多变量分析（PCA和DAPC）和分子特征均一致支持存在种群水平变异而非物种水平分化。
寄主植物种类已被报道影响Pratylenchus种群的形态测量学变异，但在本研究中这一因素被最小化，因为所有种群在形态测量学评估前均在相同温室条件下使用相同寄主植物组合维持。然而，由于种群维持时间不同，不能完全排除长期维持可能对部分形态测量学变异产生贡献的可能性。
本研究的形态测量学结果与Siqueira（2007）和Fiorentin（2018）的研究成果一致，均报告了P. brachyurus种群基于形态测量学特征的种内变异，在多变量分析中将种群分为不同组群。分子水平上，研究结果与Machado et al.（2015）一致，ITS-1区域是确认物种身份和检测种内变异性的有效标记。然而，分子和形态测量学分组并不完全一致，表明单独使用ITS-1区域可能无法代表种群间的所有变异性。
研究的分子分析观察到PbGA种群个体与中国和美国来源种群之间的密切关系。研究人员认为，可能归因于国家间交换被寄生虫侵染的香茅属（Cymbopogon sp.）和落花生（Arachis hypogaea）幼苗，这对获取此类幼苗的国家构成植物检疫风险。Oliveira和Guerreiro Filho（2022）强调了应用高效缓解策略的重要性，如生产无病原体的认证幼苗。
除了研究的P. brachyurus种群间观察到的种内变异性外，来自PbGA种群单一雌虫的克隆系中也报告了个体内变异性。Machado et al.（2015）也报告了克隆的ITS-1序列间的变异，表明rDNA拷贝间存在微异质性。个体内变异性的起源尚不确定，但可能与基因组内变异有关。Nyaku et al.（2013）提出了基因转换或不等交换过程中的重组作为可能的解释。Nyaku et al.（2024）进一步推测可能是由于单个线虫内存在多个ITS-1拷贝，由核苷酸变化和序列内短重复基序的数量变化产生。
系统发育分布模式和形态学差异增强了一个认识：P. brachyurus是一个具有广泛遗传多样性的物种，不同种群可主要通过地理区位和寄主在形态学和分子学上加以区分。通过联合评估分子和形态测量学分析，研究人员证明了所研究种群间存在变异。值得注意的是，P. brachyurus中存在的孤雌生殖（parthenogenesis）方式倾向于通过快速种群扩张促进线虫的致病性，因为无需依赖两性交配。一个种群可以从单一雌虫开始。对于像P. brachyurus这样的迁移性内寄生线虫，这一特征有助于在根系中达到高密度，增加组织穿透和迁移频率、病变数量以及对继发感染的易感性，从而导致作物更显著的症状和损失。此外，孤雌生殖有助于维持种内变异性，使线虫种群能够在不同环境和寄主中克隆性扩散。
因此，本研究采用的分子技术作为形态测量学分析的补充，使两种方法获得的数据得以比较，并汇聚于对这些生物体本质的更深入分析。在实践中，对种群间多样性的全面了解有助于选择更合适的植物寄生线虫管理策略，并强调了在将抗性基因纳入新咖啡品种的育种计划中需要考虑观察到的种内变异性的必要性。
研究结论表明，通过整合分类学方法，结合形态测量学与遗传学证据，研究人员证明了P. brachyurus种群间存在种内变异，且形态测量学分组与分子分组结果不完全一致，提示未来研究需要探讨咖啡来源种群（尤其是PbGA）相对于其他种群的攻击性差异。
