植物病毒抑制子HcPro与P19抑制CRISPR-Cas13介导的转录干扰

《Stress Biology》：Plant viral suppressors HcPro and P19 inhibit CRISPR-Cas13-mediated transcript interference

RNA在细胞动态过程中扮演核心角色，介导从遗传信息到蛋白质的形成。因此，能够改变细胞RNA含量以实现预期结果的技术备受关注。靶向RNA的CRISPR-Cas13能够实现精确的、序列引导的RNA靶向，从而破坏翻译过程，因此可用于细胞工程。然而，CRISPR系统的引导RNA（guide RNA）能够独立于Cas13蛋白沉默靶标转录本，这使CRISPR-Cas13在生物技术中的应用复杂化。为防止Cas13非依赖性沉默并促进Cas13介导的转录本减少，研究人员探索了利用RNAi的病毒抑制子（viral suppressors of RNAi）。在此，研究人员报告称，两种RNAi病毒抑制子HcPro和P19的表达意外地阻断了Cas13介导的转录沉默以及Cas13非依赖性的类RNAi沉默。为进一步理解HcPro如何阻断Cas13介导的沉默，研究人员表达了一个RNA沉默缺陷型HcPro突变体用于RNA靶向检测。结果表明，突变型HcPro未能抑制Cas13依赖性沉默，这表明HcPro的RNAi抑制活性同样干扰了Cas13沉默。这些结果提示，植物病毒可能通过先前进化出的RNAi沉默抑制子的活性，具备克服工程化CRISPR-Cas13抗病毒能力的潜力。

研究背景与问题

基因组工程技术在现代生物技术中为作物改良和精准育种提供了强大且高效的手段。锌指核酸酶（ZFN）、TAL效应子核酸酶（TALEN）以及CRISPR-Cas9等工具已被广泛应用于多种植物的靶向基因编辑。然而，基因编辑会在基因组水平造成永久性改变，并可能在非靶标位点产生非预期编辑。相比之下，转录组工程提供了一种灵活、时空可控的RNA调控方式，用于作物改良和病毒抗性。植物中传统的RNA靶向工具包括反义RNA、发夹RNA（hairpin RNA）以及人工microRNA（amiRNA），这些技术利用了内源性RNA干扰（RNAi）通路，但可能产生脱靶沉默，限制了其应用。此外，基于这些技术的抗病毒策略可被病毒编码的RNAi抑制子（VSR）所克服。

VI型CRISPR-Cas13系统（如Cas13a、Cas13d）已成为一种替代性的特异性RNA切割工具。但此前研究发现，仅表达28个核苷酸长度的CRISPR RNA（即引导RNA）即可在缺乏Cas13蛋白的情况下引起显著的转录本沉默，这种现象被称为引导诱导的基因沉默（GIGS），且很可能依赖于RNAi机制组件。这种Cas13非依赖性的类RNAi靶标沉默可能导致脱靶效应，削弱CRISPR-Cas13的应用价值。因此，理解这一现象并开发缓解策略对于Cas13在性状工程中的部署至关重要。

研究人员最初假设，利用VSR抑制RNAi，可以在不影响Cas13活性的前提下消除Cas13非依赖性沉默。为此，研究人员选择了两个特征明确的VSR——来自芜菁花叶病毒（TuMV）的辅助成分蛋白酶（HcPro）和来自番茄丛矮病毒（TBSV）的P19进行测试。

主要研究方法

本研究采用了农杆菌浸润法（agroinfiltration）在本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片中进行瞬时表达实验。关键方法包括：构建含有LbuCas13、多引导RNA（m-guide）、HcPro、P19或GUS对照的二元载体，转化至根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101；通过Western blotting检测GFP蛋白积累量并使用ImageJ进行定量；通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Northern blotting检测内源八氢番茄红素脱氢酶（PDS）转录本水平；采用定点诱变技术构建HcPro的RNA沉默缺陷型突变体（AS9）。

研究结果

1. HcPro的表达抑制Cas13非依赖性和Cas13介导的TuMV沉默

研究人员将靶向TuMV的多引导RNA（m-guide）与非靶向对照多引导RNA（NT-guide）分别与Cas13共表达或不共表达，同时共表达HcPro或GUS对照。结果显示，在无HcPro（GUS对照）情况下，m-guide有效降低了TuMV积累。而HcPro的表达不仅抑制了Cas13非依赖性的TuMV靶向，还出乎意料地减少了Cas13介导的TuMV干扰。Western blotting定量表明，HcPro使Cas13非依赖性测定中的GFP信号恢复约20%，而在Cas13介导的靶向中则使GFP积累增加了近六倍。

2. TBSV P19同样抑制Cas13非依赖性和Cas13依赖性的TuMV干扰

为验证其他VSR的作用，研究人员表达了P19。结果与HcPro一致：P19的表达同样抑制了Cas13非依赖性和Cas13介导的TuMV靶向。Western blotting定量显示，P19使Cas13非依赖性和Cas13介导的TuMV靶向测定中的GFP积累分别增加33%和78%。

3. HcPro和P19抑制Cas13非依赖性和Cas13介导的内源转录本沉默

为确定上述抑制作用是否仅限于病毒RNA，研究人员测试了对内源靶标PDS的影响。qRT-PCR数据表明，在GUS与m-guide及Cas13共表达时，PDS转录本减少60%；而当HcPro或P19与m-guide及Cas13共表达时，PDS转录本水平与NT-guide对照组相似，证明HcPro和P19抑制了Cas13介导的PDS干扰。Northern blotting结果进一步验证了这一结论。

4. HcPro的RNA沉默抑制子活性是其抑制Cas13介导的转录干扰所必需的

为探究作用机制，研究人员使用了HcPro的AS9突变体，该突变体丧失了siRNA结合能力和RNAi抑制活性。结果显示，野生型HcPro（HcPro_WT）抑制了Cas13介导的PDS降低，而HcPro_AS9突变体则无法抑制Cas13介导的PDS转录本沉默，表明HcPro的抗CRISPR-Cas13功能与其RNAi抑制活性直接相关。

讨论与结论

植物利用RNAi作为抵御病毒感染的主要防御机制，而病毒则进化出了VSR来对抗RNAi。本研究的最初目标是利用VSR特异性地消除Cas13非依赖性沉默，同时维持Cas13活性。然而，结果揭示HcPro和P19意外地抑制了Cas13非依赖性和Cas13介导的两种沉默途径。

虽然大多数已知的抗CRISPR蛋白（Acr）靶向DNA切割型的CRISPR-Cas9，但近期研究也发现了靶向CRISPR-Cas13的Acr。植物病毒不太可能经历细菌CRISPR-Cas系统的选择压力，但本研究表明它们确实具有Cas13抑制效应。HcPro_AS9突变体的实验结果提示，HcPro干扰Cas13引导RNA可能是由于RNAi的小RNA与Cas13引导RNA之间存在结构相似性，两者都依赖于蛋白质-RNA复合物的形成。HcPro和P19均通过结合双链siRNA中间体来抑制RNAi，阻止活性RISC复合物的形成，暗示VSR可能干扰了引导RNA。

有趣的是，此前成功利用Cas13在植物中建立病毒抗性的研究往往靶向了VSR序列本身，这可能通过限制VSR蛋白积累而偏向于植物免疫。另有研究显示，稳定表达Cas13-crRNA的转基因马铃薯植株对PVY具有抗性，但在混合感染中该抗性被打破。这说明Cas13-crRNA复合物在病毒感染前的提前形成可能是关键因素。在瞬时表达实验中，Cas13、crRNA和VSR同时递送，允许VSR积累并抑制Cas13-crRNA复合物的形成，从而导致抗性丧失。

研究结论：本研究的结果表明，HcPro和P19可作为抗CRISPR-Cas13蛋白，抑制Cas13介导的对病毒靶标（TuMV）和内源靶标（PDS）的沉默。此外，数据表明HcPro的RNAi沉默抑制子活性对其抗CRISPR-Cas13功能至关重要，提示HcPro通过抑制CRISPR引导RNA来干扰Cas13功能。