《Frontiers in Immunology》：Molecular basis of anti-CD36 alloimmunization: transcriptomic evidence linking intronic splice-site mutations to CD36 loss-of-function
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背景： CD36缺乏症是一种遗传性疾病，可导致胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症（FNAIT）或血小板输注无效（PTR）。虽然外显子突变导致的CD36缺乏症已有充分研究，但由内含子突变引起的RNA剪接机制仍不明确。
方法： 研究人员对CD36缺乏症患者进行了长
背景： CD36缺乏症是一种遗传性疾病，可导致胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症（FNAIT）或血小板输注无效（PTR）。虽然外显子突变导致的CD36缺乏症已有充分研究，但由内含子突变引起的RNA剪接机制仍不明确。
方法： 研究人员对CD36缺乏症患者进行了长读长测序和单倍型分析。RNA测序和等位基因特异性分析验证了患者中突变与剪接的关联。研究人员构建了CD36异常转录本质粒，并通过流式细胞术进行评估。对健康供者的外显子组测序确定了突变频率。
结果： 人群筛查显示，在中国健康供者中，c.430-1G>C突变的携带频率约为2/800，c.429+3insG突变的携带频率约为3/800。本研究纳入了七例伴有PTR或FNAIT的I型CD36缺乏症患者。等位基因特异性分析证实，突变等位基因在异常转录本中显著富集（P=0.024）。长读长测序显示，一名患者仅携带两个内含子突变（c.430-1G>C和c.429+3insG），表明内含子突变与I型CD36缺乏症显著相关。具体而言，c.430-1G>C突变诱导外显子6异常剪接，导致17-bp假内含子插入或外显子6完全跳跃（跳跃率分别为28.6%或30.3%）；c.429+3insG突变导致外显子5跳跃（跳跃率为38.3%）。功能实验表明，c.430-1G>C突变导致CD36蛋白表达完全丧失。
结论： 本研究证实，单独的内含子突变也可通过损害mRNA剪接诱导CD36缺乏症，从而扩展了已知的CD36缺乏症突变谱，并强调了在诊断和发病机制研究中筛查内含子突变的必要性。
研究背景
CD36（又称GPIV）是一种在血小板、单核细胞和内皮细胞上表达的跨膜糖蛋白。I型CD36缺乏症表现为血小板和单核细胞上CD36水平均降低，而II型缺乏症则仅表现为血小板表面CD36缺失。I型缺乏症个体可能通过输血、妊娠和移植产生同种抗体，进而导致血小板输注无效（PTR）、胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症（FNAIT）和输血相关急性肺损伤（TRALI）。该病在不同地区和种族中的发生率差异显著，亚洲人群发病率相对较高（3%-10%），其中中国人群中I型缺乏症约占0.2%-0.5%，II型缺乏症约占1.2%-2.0%。
目前，超过20种编码区突变被报道可引起I型CD36缺乏症，其中c.329-330delAC、c.1228-1239delATTGTGCCTATT和c.268C>T约占病例的90%。然而，绝大多数突变分析集中于外显子区域，内含子突变鲜有报道。外显子组测序的限制、不准确的剪接预测以及稀缺的患者组织样本，使得大多数内含子变异在临床上无法分类。尽管已有少数内含子突变（如内含子12的1200-13A>G和内含子3的(TG)12TAA(TG)2重复序列）被报道与CD36缺乏症相关，但其分子机制——尤其是通过影响RNA剪接导致疾病的具体途径——仍不清楚。因此，研究人员旨在利用长读长测序和患者来源的等位基因特异性剪接分析，系统探究内含子突变在CD36缺乏症发病中的作用。
主要技术方法
研究人员从广州血液中心招募了7例确诊为I型CD36缺乏症的中国患者（2015-2022年），并随机招募了800名健康血样供者作为对照人群。采用长读长测序（第三代测序技术，TGS）对CD36突变进行定相和单倍型分析；对携带内含子突变的患者进行血小板/单核细胞RNA测序（RNA-seq），并使用Trimmomatic、STAR、SAMtools和Picard Tools等工具进行生物信息学分析；通过等位基因特异性分析和Fisher精确检验验证突变与异常剪接的关联；构建Flag标签的野生型和突变型CD36 mRNA转录本质粒，转染HEK-293T细胞后，利用流式细胞术检测CD36蛋白表达水平。
研究结果
一例仅由内含子突变引起I型CD36缺乏症的患者
对7例女性患者的CD36基因（外显子1-15）进行分析发现，5例携带双外显子突变（包括c.380C>T、c.1156C>T、c.1163A>T和c.329-330delAC），而患者3是一个独特案例，仅携带两个位于内含子5的内含子变异（c.430-1G>C和c.429+3insG），没有任何外显子突变。患者7则携带一个外显子突变（c.329-330delAC）和内含子变异c.430-1G>C。所有患者均表现出CD36在血小板和单核细胞上的完全缺失，并检测到CD36特异性抗体。这一发现提示这些内含子改变可能是驱动CD36缺乏症的关键因素。
RNA测序分析揭示内含子突变介导的异常剪接及其等位基因特异性验证
对患者3的RNA-seq数据进行分析，发现在覆盖c.430-1G>C位点和外显子5-外显子6连接区域的13条reads中，6条支持异常剪接（17-bp假内含子保留或外显子6跳跃），7条支持正常剪接。所有正常剪接的reads均携带参考G等位基因，而4条异常剪接的reads携带突变C等位基因。统计检验证实突变C等位基因在异常剪接reads中显著富集（比值比[OR]=27.0，95%置信区间[CI]：1.56 - ∞；P=0.024），表明异常剪接具有等位基因特异性。此外，还鉴定出4条发生外显子5跳跃的reads，可能与c.429+3insG突变有关。定量分析显示，患者3中外显子6跳跃的比例为30.3%，外显子5跳跃的比例为38.3%，而正常对照中这两项比例分别仅为0%-0.5%和0%-1%。
c.430-1G>C内含子突变导致CD36表达受损
流式细胞术结果显示，转染野生型CD36的293T细胞表面检测到强烈的CD36蛋白表达。相比之下，转染c.430-1G>C_17insert（17-bp插入）或c.430-1G>C_Δexon6（外显子6缺失）突变体的细胞均未检测到特异性CD36表达，其荧光信号与阴性对照组完全重叠，表明这两种剪接变体均导致CD36蛋白的完全缺失。
中国血样供者中CD36缺乏症的突变频率
对800名中国血样供者的外显子组测序发现，2人（2/800）携带c.430-1G>C杂合突变，3人（3/800）携带c.429+3insG杂合突变，等位基因频率分别为0.25%和0.375%。与全球东亚人群的gnomAD数据库频率（0.098%和0.087%）相比，这两个突变在中国血样供者中的携带频率更高，分别高出约2.5倍和4.3倍。
讨论与结论
本研究首次证明，仅靠内含子突变即可独立诱导CD36缺乏症。研究人员在一位I型CD36缺乏症患者中发现两个新的内含子5突变（c.430-1G>C和c.429+3insG），并通过RNA-seq和等位基因特异性分析证实它们分别导致外显子6和外显子5的异常跳跃。功能实验进一步确认c.430-1G>C突变造成的17-bp插入或外显子6缺失均使CD36蛋白表达完全丧失。人群筛查显示这两个突变在中国人群中的携带频率虽低，但高于东亚整体水平。这些发现扩展了CD36缺乏症的已知突变谱，揭示了内含子区域剪接位点突变通过干扰mRNA剪接导致疾病的分子机制。研究结论强调，在CD36相关同种免疫性疾病的临床分子诊断中，必须将内含子区域——特别是经典剪接位点——纳入常规筛查范围，这对于准确诊断和深入理解疾病发病机制具有重要意义。
