《Frontiers in Immunology》：Longitudinal plasma proteome profiling after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: heterogeneous development and associations with acute GvHD
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异基因造血干细胞移植（HSCT）为恶性及非恶性造血系统疾病提供了潜在治愈手段，但供者免疫细胞介导的炎症反应及宿主组织破坏所导致的急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease, GvHD）仍是重大临床挑战。目前难以预测患者是
异基因造血干细胞移植（HSCT）为恶性及非恶性造血系统疾病提供了潜在治愈手段，但供者免疫细胞介导的炎症反应及宿主组织破坏所导致的急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease, GvHD）仍是重大临床挑战。目前难以预测患者是否及何时会发生急性GvHD。研究人员采用基于质谱（mass spectrometry, MS）的蛋白质组学技术，鉴定与异基因HSCT及急性GvHD发生相关的血浆蛋白。本研究分析了10例异基因HSCT受者在基线（移植前）、移植后1、3、6及12个月的纵向血浆样本，其中7例发生急性GvHD，另纳入5例健康供者作对照。正如预期，异基因HSCT受者与健康供者血浆蛋白质组存在显著差异，且差异在移植后3个月最为显著。与健康供者相比，4种蛋白（C4A、FTL、GNPTG、S100A9）在移植前即发生改变并持续改变至移植后12个月，另有3种蛋白（VWF、RNASE4、B2M）仅在移植后出现改变。此外，共表达分析显示炎症相关蛋白（ITIH3、ITLN1、COLEC11、SERPING1、SERPIND1及IgG）与急性GvHD分级相关。综上，研究人员证明了血浆蛋白质组学分析可支持异基因HSCT受者急性GvHD的监测。
异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）是多种恶性及非恶性血液系统疾病的重要治愈手段，但急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease, GvHD）作为供者免疫细胞攻击宿主组织所致的严重并发症，显著限制了其临床应用。目前临床上缺乏能够可靠预测或早期检测急性GvHD的生物标志物，现有标志物如ST2和Reg3α多侧重于GvHD发生后的预后判断，难以满足移植前风险分层和早期干预的需求。基于质谱（mass spectrometry, MS）的高通量血浆蛋白质组学能够无偏定量分析数百种血浆蛋白，为发现新的疾病相关蛋白和分子通路变化提供了有力工具。为此，研究人员开展了一项前瞻性纵向队列研究，旨在描绘异基因HSCT前后血浆蛋白质组的动态演变，并筛选与急性GvHD发生及严重程度相关的血浆蛋白标志物。
该研究利用了荷兰阿姆斯特丹UMC医学伦理委员会批准的前瞻性生物样本库，纳入10例接受减低强度预处理（RIST，白消安/氟达拉滨或环磷酰胺/氟达拉滨方案）的异基因HSCT受者，其中9例来自HOVON 96临床试验第1、2组（短程/长程环孢素A联合霉酚酸预防GvHD），1例来自第3组（移植后环磷酰胺预防GvHD）。7例受者在移植后100天内诊断急性GvHD。另采集5例健康成人血浆作为对照（按荷兰法规及Sanquin伦理顾问委员会批准）。血浆样本取自移植前基线（0–7天）及移植后1、3、6、12个月共5个时间点。
主要技术方法包括：采用数据非依赖性采集（data-independent acquisition, DIA）模式的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪进行蛋白质组学分析，原始数据经DIA-NN软件（版本1.8）以无图谱库预测搜索方式比对人类蛋白质组数据库（Swiss-Prot，20,361条条目）；使用R语言limma包进行差异蛋白丰度分析（P-adj<0.05，Benjamini-Hochberg校正，|log
2FC|>1）；通过计算变异系数（CV）和log2倍数变化（LFC）评估个体内纵向变化与个体间差异；采用Hmisc包进行Spearman相关性分析，并将临床实验室参数、ELISA检测值（如钙卫蛋白）与质谱蛋白质定量结果进行全局相关分析；针对免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）同型特异性肽段进行提取和平均化处理，以评估体液免疫重建动态。
研究结果部分主要包含三方面发现。
**结果一：质谱分析揭示异基因HSCT受者与健康供者血浆蛋白的显著差异。** 研究人员比较了各时间点与健康供者的血浆蛋白质组，共鉴定47种显著差异蛋白，其中移植后3个月差异蛋白数量最多（n=39）。该时间点也是全部7例急性GvHD患者均已确诊的最早时间点，提示急性GvHD进一步影响了移植背景下的血浆蛋白质组。差异蛋白主要表现为免疫球蛋白丰度降低，以及铁代谢（铁蛋白轻链[FTL]、铁调素[HAMP]）、炎症（S100A8、S100A9）、补体（补体C4A）等蛋白丰度升高。交叠分析显示，C4A、FTL、GNPTG和S100A9四种蛋白在所有移植前及移植后时间点均持续显著升高；VWF、RNASE4和B2M三种蛋白仅在移植后时间点显著升高，其中VWF在基线时虽已升高但未达到显著水平。
**结果二：纵向血浆蛋白质组变化以个体间差异为主。** 研究人员计算了每位受者各时间点相对基线的LFC及跨时间点CV，发现52%的蛋白表现出高个体间变异（CV>30%），而仅有少数蛋白（LFC<-1占3.5%，LFC>1占7.8%）存在显著的个体内纵向变化，表明异基因HSCT后血浆蛋白质组的个体间异质性超过个体内随时间的变化。免疫球蛋白相关蛋白及炎症蛋白（IGHD、SAA1、S100A8/A9）表现出显著的时间和个体间波动，且免疫球蛋白同型特异性肽段水平显示每个患者的体液免疫重建模式各不相同。
**结果三：相关分析揭示与临床指标及急性GvHD分级关联的血浆蛋白。** 全局相关性分析显示，肝酶天冬氨酸氨基转移酶（AST）与多聚免疫球蛋白受体（PIGR，r=0.62）和氨肽酶N（ANPEP，r=0.54）正相关；丙氨酸氨基转移酶（ALT）与果糖二磷酸醛缩酶（ALDOB，r=0.67）、延胡索酰乙酰乙酸水解酶（FAH，r=0.61）和PIGR（r=0.52）正相关。ELISA检测的钙卫蛋白（S100A8/S100A9复合物）与质谱定量结果呈中等正相关（r=0.43和r=0.44），验证了方法的可靠性。血小板计数与血栓海绵蛋白-1（THBS1，r=0.76）、血小板碱性蛋白（PPBP，r=0.75）和血小板因子4（PF4，r=0.66）高度相关。针对急性GvHD分级的相关分析发现，纳入所有时间点时，间α-胰蛋白酶抑制剂重链H3（ITIH3，r=0.56）和 intelectin-1（ITLN1，r=0.57）与GvHD分级正相关，而collectin-11（COLEC11，r=-0.71）与GvHD分级负相关；仅纳入GvHD确诊后时间点时，C1抑制剂（SERPING1，r=0.63）与GvHD分级正相关；两种分析中IgG丰度均与急性GvHD分级呈负相关。
讨论与结论方面，研究人员指出，移植前受者的血浆蛋白质组已因基础疾病和预处理导致的组织损伤而偏离健康状态，这种偏离在移植后进一步加剧。移植后3个月时差异蛋白数量达到高峰，与全部患者均已诊断急性GvHD的时间点重合，支持炎症反应在急性GvHD发病机制中的核心作用。免疫球蛋白个体化重建模式与既往报道的移植后体液免疫恢复缓慢一致。虽然所发现的蛋白标志物与Paczesny实验室及MAGIC研究中的标志物（如Reg3α、ST2）不同，这可能与研究设计（GvHD发病前预测 vs. 发病后预后判断）、样本量及疾病亚型差异有关。本研究的局限性包括样本量小、健康供者均为女性、未纳入免疫重建及慢性GvHD因素等。尽管如此，研究人员认为，基于MS的血浆蛋白质组学具有非侵入性、仅需约20 μL血浆即可实现高通量蛋白谱分析的优势，研究结果支持该技术在急性GvHD监测及未来更大规模队列研究中的潜在应用价值。研究结论可概括为：异基因HSCT受者的血浆蛋白质组在移植前即与健康供者存在差异，且移植后差异更为显著；多种与铁调节和炎症相关的蛋白在移植后持续改变至12个月；质谱蛋白质组学可有效支持急性GvHD的监测。
