基于蛋白质组学与代谢组学整合分析的沙苑子黄酮抗大鼠肝纤维化作用机制研究

《Frontiers in Pharmacology》：Integrated proteomic and metabolomic analysis reveals the mechanism of astragalus complanatus flavonoids against liver fibrosis in rats

目的：沙苑子（Astragali Complanati Semen, ACS）是一种传统中药材，常用于补肝益肾。作为ACS的主要生物活性成分，沙苑子黄酮（Astragalus complanatus flavonoids, ACF）具有肝脏保护和抗纤维化作用。本研究旨在通过整合蛋白质组学与代谢组学分析并结合实验验证，阐明ACF的抗纤维化作用机制。
方法：建立四氯化碳（CCl₄）诱导的大鼠肝纤维化（liver fibrosis, LF）模型及转化生长因子-β1（TGF-β1）激活的肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）模型，以评估ACF的抗纤维化效果。采用整合蛋白质组学与代谢组学分析，鉴定差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs）、差异表达代谢物（differentially expressed metabolites, DMs）及相关信号通路。利用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法验证关键分子靶点，并使用药理抑制剂研究FAK/AKT信号通路在ACF介导的HSC活化抑制中的作用。
结果：与LF模型组相比，ACF治疗显著改善了肝功能指标，减轻了组织病理学损伤和胶原沉积，降低了血清纤维化标志物水平，下调了Col I、Col IV和α-SMA的蛋白表达水平，并减轻了氧化应激和炎症反应。蛋白质组学筛选出401个DEPs，主要富集于细胞外基质（extracellular matrix, ECM）-受体相互作用、黏着斑（focal adhesion, FA）和PI3K/AKT信号通路。蛋白质-蛋白质相互作用分析进一步确定FN1、CD44、ITGAV、FAK和AKT1为核心靶蛋白。体外实验表明，ACF阻断了TGF-β1触发的HSC活化，降低了α-SMA和ITGAV的表达，并抑制了FAK和AKT的磷酸化。分别使用PF-562271阻断FAK或MK2206阻断AKT可增强ACF的抗纤维化活性，验证了FAK/AKT轴介导了ACF的抗HSC活化作用。代谢组学分析鉴定出108个DMs，主要富集于谷胱甘肽代谢、初级胆汁酸生物合成和碳水化合物代谢。多组学整合分析证实，ECM-受体相互作用、PI3K/AKT信号通路和初级胆汁酸生物合成通路中的DEPs与DMs之间存在密切相关性。特别地，甘氨鹅脱氧胆酸、卫矛醇和鹅脱氧胆酸盐与核心靶蛋白显示出强相关性。
结论：ACF通过抑制FAK/AKT1信号传导以阻滞HSC活化，同时协调调控关键代谢通路，从而实现全面的抗LF效果。

肝纤维化（liver fibrosis, LF）是慢性肝病向肝硬化进展的关键病理环节，全球疾病负担研究数据显示，2021年肝硬化已成为全球第12位死因。LF的病理本质在于细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的过度产生和异常沉积，导致肝纤维瘢痕形成并逐渐破坏正常肝脏微结构。LF早期临床症状缺乏特异性，给早期诊断带来挑战。尽管LF在早期甚至中期具有可逆性，但全球范围内尚无正式获批用于LF特异性治疗的药物，部分候选化合物虽已进入II/III期临床试验，其疗效和安全性尚未充分验证。LF发病机制的高度复杂性和多因素性——涉及炎症反应、氧化应激、代谢紊乱、ECM重塑及多条细胞信号通路的交互调控——使得针对单一通路的干预策略难以取得理想疗效。因此，深入解析LF的分子机制，并在此基础上开发安全、有效、多靶点协同的干预策略具有重要的临床意义。传统中药（traditional Chinese medicine, TCM）以其“多成分、多靶点、多通路”的协同作用和整体调节机体的核心优势，在肝脏疾病治疗中应用广泛。沙苑子（Astragali Complanati Semen, ACS）是豆科植物扁茎黄芪的干燥成熟种子，首载于《本草纲目》，传统上用于补肝益肾、明目。沙苑子黄酮（Astragalus complanatus flavonoids, ACF）作为ACS的主要活性成分，具有包括肝脏保护和抗纤维化在内的广泛药理活性。然而，ACF抗LF的分子机制，特别是涉及的特定信号通路和关键分子靶点，仍需进一步阐明。以往研究多聚焦于单一生物标志物或单一信号通路，难以全面解释ACF复杂的药理特性，蛋白质水平调控变化与代谢重塑之间的相互作用尚未得到系统阐明。因此，本研究通过整合蛋白质组学与代谢组学分析，系统鉴定ACF调控的关键差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs）和差异代谢物（differentially expressed metabolites, DMs），并在体内外验证关键信号通路和分子靶点，从蛋白质和代谢水平系统阐明ACF抗LF的作用机制。

研究人员采用四氯化碳（CCl₄）诱导的大鼠LF模型和转化生长因子-β1（TGF-β1）激活的肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）模型，评估ACF的抗纤维化效果。首先通过UPLC–Q-TOF/MS对ACF提取物进行成分鉴定，并采用紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量。随后通过组织病理学检查、血清生化指标检测、ELISA、免疫组织化学染色、Western blotting和qRT-PCR等方法评估ACF对LF大鼠的药效作用。采用4D无标记定量蛋白质组学和非靶向代谢组学技术，结合多组学整合分析，系统鉴定ACF调控的DEPs和DMs及其富集的信号通路和代谢通路。最后，利用FAK抑制剂PF-562271和AKT抑制剂MK2206，通过体外实验验证FAK/AKT信号通路在ACF介导的HSC活化抑制中的作用。动物实验使用雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（6–8周龄，180 ± 20 g），由成都达硕实验动物有限公司提供（SCXK（川）2020–030），所有程序符合陕西中医药大学动物实验指南并经机构伦理委员会批准（No. SUCMDL20221017001）。HSC-T6细胞购自北京北创联生物技术研究所。

研究人员首先对ACF提取物进行成分鉴定，共表征了22个化合物，主要包括杨梅素-3-芸香糖苷、杨梅素3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素3-O-接骨木二糖苷、金丝桃苷、大麻苷、沙苑子苷B、沙苑子苷、鸢尾苷元7-O-木糖基葡萄糖苷等黄酮类成分，总黄酮含量为77.25%（以芦丁当量计）。在动物水平上，ACF治疗显著改善了CCl₄诱导LF大鼠的肝功能指标（ALT、AST、ALP、TBA和ALB），减轻了体重下降和肝脾指数升高，降低了血清炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）水平，恢复了肝脏SOD和GSH水平，表现出抗炎和抗氧化作用。ACF还显著降低了血清纤维化标志物（Col-IV、HA、LN、PC-III和HYP）水平，改善了肝组织病理学损伤，减少了胶原沉积和α-SMA阳性区域，并下调了Collagen I、Collagen IV和TGF-β1的蛋白表达。蛋白质组学分析显示，与模型组相比，ACF给药后筛选出401个DEPs，主要富集于ECM-受体相互作用、黏着斑（focal adhesion, FA）和PI3K/AKT信号通路。蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络分析确定FN1、CD44、ITGAV、FAK和AKT1为核心靶蛋白。qRT-PCR和Western blotting验证结果表明，ACF显著下调了LF大鼠肝脏中AKT1、FN1、FAK、CD44和ITGAV的mRNA和蛋白表达水平。体外实验表明，ACF（0.2和0.5 μg/mL）无明显细胞毒性，可显著抑制TGF-β1激活的HSC-T6细胞活力，下调α-SMA和ITGAV蛋白表达，降低p-AKT1/AKT1和p-FAK/FAK比值，并抑制炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌。进一步采用药理抑制剂实验证实，FAK抑制剂PF-562271或AKT抑制剂MK2206单独处理均可逆转TGF-β1诱导的HSC活化标志物上调，且与ACF联合处理效果增强，验证了FAK/AKT轴介导了ACF的抗HSC活化作用。代谢组学分析显示，与模型组相比，ACF治疗后鉴定出108个DMs，主要富集于谷胱甘肽代谢、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢以及果糖和甘露糖代谢通路。多组学整合分析揭示了48条蛋白质-代谢物协同调控通路，其中甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）、卫矛醇和鹅脱氧胆酸盐与核心靶蛋白（如CD44、ITGAV、FN1和AKT1）显示出显著相关性。

在讨论部分，研究人员指出ACF通过抑制ECM-受体相互作用、FA和PI3K/AKT三条核心通路发挥抗LF作用。ECM通路是FA和PI3K/AKT信号通路的重要组成部分，ITGAV作为整合素家族成员，可激活FA信号通路进而刺激PI3K/AKT通路；FN1主要由活化的HSC产生，调节细胞黏附、迁移和增殖；CD44在肝脏中主要由HSC表达，其表达随纤维化进展而增加。FA通路对HSC活化至关重要，FAK作为FA信号通路中的关键细胞质酪氨酸激酶，其上调可促进HSC活化。FAK通过Y397位点磷酸化被整合素介导的信号激活后，触发PI3K存活信号级联，诱导AKT磷酸化，最终促进HSC活化。AKT1作为PI3K/AKT通路中调节凋亡的关键激酶，其活化状态可影响HSC的增殖和凋亡。药理抑制剂实验证实，ACF通过阻断FAK/AKT1信号级联抑制HSC活化。值得注意的是，研究人员承认该研究未设置抑制剂单独处理的对照组，限制了对通路抑制独立效应与抑制剂和ACF协同效应的区分能力。代谢组学分析表明，谷胱甘肽代谢是最具影响力的代谢通路，与蛋白质组学揭示的抗炎和抗氧化机制相对应；初级胆汁酸生物合成通路的富集提示ACF可能对肠道微生物组和脂质代谢具有潜在调节作用；氨基酸和葡萄糖代谢通路的富集表明ACF可通过改善能量代谢效率减轻LF进展过程中的能量代谢紊乱。多组学整合分析构建了从分子靶点到代谢表型的全面机制网络，验证了ACF的“蛋白质调控—代谢改善—病理缓解”双重调控模型。

研究结论表明，ACF通过抑制FAK/AKT1信号依赖性HSC活化，协调调控关键代谢通路，在蛋白质和代谢水平上发挥抗纤维化作用。具体而言，ACF通过调控ECM-受体相互作用、FA和PI3K/AKT三条核心通路，下调CD44、ITGAV、FN1、FAK和AKT1等关键蛋白的表达和磷酸化水平，阻断FAK/AKT1信号轴的异常激活，从而抑制HSC增殖和活化。在代谢水平上，ACF显著逆转了LF诱导的代谢紊乱，差异代谢物主要富集于谷胱甘肽代谢、初级胆汁酸生物合成和果糖/甘露糖代谢等通路，从而减轻氧化应激并改善能量代谢紊乱。多组学整合分析进一步构建了DEPs、DMs和核心通路之间的关联网络，揭示了ACF在蛋白质介导的细胞活化和代谢介导的胆汁酸稳态及葡萄糖代谢紊乱中的双重调节作用，形成“蛋白质调控—代谢改善—病理缓解”的正反馈回路。ACF代表了治疗LF的一个潜在的多靶点、多通路治疗候选药物，为其临床转化提供了实验依据。