跨平台标准化人类TBMNK细胞流式检测：面向AI就绪参考数据集的新框架

《Frontiers in Immunology》：Standardizing a human TBMNK cell assay across instrument platforms: a new framework for producing high-quality, AI-ready reference dataset

中文翻译（摘要） 引言： 再生医学先进疗法（RMAT）的最新进展正通过为既往无法治愈的疾病提供治愈性治疗方案而彻底改变医疗保健领域。流式细胞术检测已被用于测量RMAT的关键质量属性，包括活性、特性、纯度、效力及效能。然而，结果在不同流式细胞仪平台、不同站点及不同时间之间缺乏可重复性、可比性和测量置信度，这仍是一项重大挑战。 方法： 通过一项由NIST流式细胞术标准联盟协调的大规模实验室间研究（ILS）——一个公私合作伙伴关系，研究人员开展研究以鉴定T/B/单核细胞/自然杀伤细胞（TBMNK）并测量细胞活性和健康状态。该ILS使用共同研究样本、配套的仪器控制和检测试剂，以及四项标准操作程序（SOPs），在21个站点的7家制造商的42台细胞仪上实现了端到端的检测标准化。 结果： 研究人员首次证明了在广泛仪器平台范围内实现标准化细胞计量检测的可行性。ILS的结果以具有国际单位制（SI）计量溯源性的定量单位报告：细胞计数以每微升细胞数表示，CD标志物表达水平以等效参考荧光团（ERF）单位表示。该标准化方法将不同仪器平台的流式细胞术数据置于标准化的ERF标尺上。 讨论： 为克服仪器驱动的变异性挑战，该ILS利用人类TBMNK细胞检测建立并验证了一个新的标准化框架。通过以SI可溯源单位报告结果，该工作证明在不同细胞仪上可实现活性、非凋亡TBMNK亚群的可比测量。所产生的高质量、人工智能（AI）就绪参考数据集为转化免疫学中AI/机器学习（ML）技术的验证提供了关键基础。此外，该研究强调，整合自动化样本制备是进一步最小化检测不确定性和增强跨平台可重复性的必要下一步。

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一、研究背景与问题

流式细胞术是当今最强大的高通量单细胞分析技术之一，在免疫学研究、疫苗与治疗药物开发、疾病诊断以及治疗监测中扮演着至关重要的角色。该技术已从HIV/AIDS患者CD4?淋巴细胞计数的金标准方法，逐步发展为造血干细胞移植中CD34?细胞计数、血癌诊断与分型、血液与自身免疫性疾病评估的关键工具，并进一步成为表征先进活细胞药物的核心技术，能够在单细胞水平同时测量多达50种标志物。2024年美国食品药品监督管理局（FDA）发布的CAR-T细胞产品开发指导文件明确将流式细胞术认定为细胞活性、特性、纯度和效力分析的关键分析工具，并建议新药临床试验申请中应包含流式细胞检测的详细描述、仪器校准与质量控制、检测SOP、抗体滴定、CAR直接检测以及全面的检测验证信息。这些建议极大地提高了对高质量、稳健且经过验证的流式细胞检测的需求。

然而，尽管在流式细胞仪校准、标准化以及检测协调方面已有诸多努力，挑战依然存在。这主要源于技术的复杂性、参考标准的缺乏，尤其是不同仪器、不同站点及不同时间之间测量置信度和可比性的不足。这些挑战阻碍了研究、生产和临床应用中一致的关键决策。此外，公共领域中高质量、注释完善的流式细胞数据集的稀缺限制了人工智能和机器学习（AI/ML）方法的发展，也阻碍了流式细胞数据与组学数据集的整合以支持精准医学的系统生物学方法。

为应对这些未满足的挑战，NIST于2020年启动了流式细胞术标准联盟（FCSC），与关键利益相关方合作共同制定标准与测量解决方案。本研究即由第二工作组（WG2）主导的首个实验室间研究（ILS），旨在利用基于流式细胞术的T/B/单核细胞/自然杀伤细胞（TBMNK）检测作为主要模型，实现细胞计数和健康检测的标准化。

二、研究内容与结论概述

研究人员通过一项大规模实验室间研究，在21个站点的7家制造商的42台细胞仪上实现了TBMNK细胞检测的端到端标准化。研究使用共同的测试样本、仪器控制材料和检测试剂，以及四项标准操作程序（SOPs），将检测结果以具有SI计量溯源性的定量单位报告——细胞计数以每微升细胞数表示，CD标志物表达水平以等效参考荧光团（ERF）单位表示。研究首次证明了在广泛仪器平台范围内实现标准化细胞计量检测的可行性，表明在不同细胞仪上可实现活性、非凋亡TBMNK亚群的可比测量。所产生的高质量、AI就绪参考数据集为转化免疫学中AI/ML技术的验证提供了关键基础，同时研究强调整合自动化样本制备是进一步最小化检测不确定性和增强跨平台可重复性的必要下一步。

三、关键技术方法概述

该研究采用了多项关键技术方法以实现跨平台标准化。研究由NIST流式细胞术标准联盟协调，涉及17个联盟成员组织、21个站点、7家仪器公司的42台细胞仪，仪器类型涵盖常规型、光谱型和成像型细胞仪，配备不同类型的光电探测器。研究样本包括来自3名健康供体的冷冻保存外周血单个核细胞（cryoPBMC，来自AllCells公司）和冻干PBMC（lyoPBMC，来自英国国家生物标准与控制研究所NIBSC），以及Slingshot Biosciences公司的TruCytes合成细胞作为质控样本。研究制定了四项SOP：SOP-01规定了仪器设置、表征和校准（使用Rainbow 8峰校准颗粒和8种不同荧光控制FC微球）；SOP-02规定了三种补偿矩阵的制备和采集（包括基于细胞和基于微球的补偿方法）；SOP-03定义了样本制备、荧光减一（FMO）对照和文件命名协议；SOP-04建立了设门策略和数据分析流程。核心标准化方法包括：利用NIST参考荧光团溶液建立ERF标尺，将仪器通道转换为仪器无关的ERF单位；利用Rainbow 8峰校准颗粒建立荧光检测器线性；通过修改的quantiFlash?自动化电子表格计算检测器灵敏度（Q值）；以及采用集中式自动化数据分析（CDA）流程与站点人工分析结果进行对比验证。

四、研究结果

3.1 数据文件的QC检查结果： 研究对42台仪器采集的2382个FCS数据文件进行了质量控制检查，其中2266个文件通过。然而，仅42台中的32台仪器通过了整体质量检查（要求完整的8峰校准颗粒数据、FC微球数据以及无缺失的PBMC样本文件）。因此，仅对这32台细胞仪报告的结果进行了分析。

3.2 细胞亚群百分比和细胞亚群计数： 结果显示，细胞百分比和计数在不同样本处理仪器间保持一致但存在差异。TruCytes样本在主要细胞亚群群体（除NK细胞外）中表现出比PBMC更高的一致性。研究还表明，基于细胞和基于微球的补偿矩阵效果同样良好，三种补偿矩阵下CD3? T细胞百分比结果具有可比性。

3.3 CD标志物表达分析： 通过ERF校准方法，研究实现了跨不同细胞仪的CD标志物表达标准化。除供体3的CD4 PE-Cy7外，7种标志物在3名供体中的表达水平变异系数（CVs）均低于50%，其中CD19 APC和CD45 PerCP-Cy5.5的CVs低于20%。以CD19 APC在供体2上的表达为例，原始中位荧光强度（MdFI）值在不同平台间差异超过42倍（CV为122%），而ERF值则保持一致（CV<19.9%），充分展示了ERF单位在跨平台标准化中的优越性。

3.4 检测器灵敏度： 研究人员首次以标准化可溯源单位Spe/ARI（统计光子电子/ARI）确定了细胞仪检测器灵敏度。在两种最具代表性的仪器平台中，配备雪崩光电二极管（APD）检测器的Aurora细胞仪在所有8个荧光检测器上均表现出比配备光电倍增管（PMT）检测器的FACSCanto细胞仪更高的Q值。

3.5 人工分析与CDA结果比较： 通过比较站点人工分析和集中式自动化数据分析（CDA）得出的CD3?淋巴细胞百分比，研究发现CDA将3名供体PBMC的CD3?淋巴细胞百分比CV从人工分析的>30%降低至约15%，表明自动化数据分析流程可以进一步消除设门过程中的技术变异性。

五、讨论部分总结

研究通过方差分析（ANOVA）评估了技术变异的来源，发现“样本处理-仪器-人工分析”变量是主要的不确定性来源。TruCytes样本在主要细胞亚群群体上的高一致性表明仪器并非主要变异来源，而PBMC样本的细胞百分比和计数结果推断样本制备是主要贡献因素。PBMC解冻、洗涤和染色等操作极易受操作者间差异影响。研究还讨论了ERF方法相对于基于抗体结合数（ABC）方法的优势与局限，指出ERF值虽不直接关联生物学内容，但规避了QuantiBrite PE校准仅限PE通道以及CD4参考标志物方法需参考PBMC样本等限制。对于CD4 PE-Cy7和CD16/CD56 PE表达水平CV大于40%的较大不确定性，研究归因于PE和PE-Cy7检测器在不同激光激发波长下的差异，以及Nile Red作为PE-Cy7参考荧光团在780nm处荧光极弱的问题。研究还指出FCS文件缺乏检测器滤光片信息和标志物-检测器关联信息，强调了遵循MIFlowCyt标准的重要性。

六、研究结论

缺乏标准化方法来实现跨不同平台的定量和可溯源细胞计量结果，历来阻碍了免疫学中AI/ML评估所必需的参考数据集的发展。这项实验室间研究通过利用人类TBMNK细胞检测验证一种新颖的标准化框架，成功解决了这一空白。通过以SI可溯源单位——具体而言，绝对计数以每微升细胞数表示、CD标志物表达以ERF表示——报告结果，该工作证明在不同细胞仪上可实现活性、非凋亡TBMNK亚群的可比测量。所产生的高质量、AI就绪参考数据集为转化免疫学中AI/ML技术的验证提供了关键基础。最后，该研究强调，整合自动化样本制备是进一步最小化检测不确定性和增强跨平台可重复性的必要下一步。