血根碱通过激活Hippo-YAP/TAZ通路诱导成纤维样滑膜细胞凋亡并抑制炎症改善类风湿关节炎

《Frontiers in Pharmacology》：Sanguinarine ameliorates rheumatoid arthritis by activating the Hippo-YAP/TAZ pathway to induce apoptosis and suppress inflammation in fibroblast-like synoviocytes

引言：类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，以进行性关节损伤、功能障碍和全身合并症为特征。现有疗法尚不能令人满意，包括缓解率低，以及约30%的患者对一线治疗应答不佳。因此，亟需更有效的治疗策略。血根碱（sanguinarine）是一种苯并菲啶类生物碱，主要从血根草（Sanguinaria canadensis）及罂粟科（Papaveraceae）其他植物中分离得到，已有文献记录其具有显著的抗菌、抗炎和抗肿瘤特性。然而，其作为RA靶向治疗手段的潜在价值尚未得到系统研究。方法：研究人员证明，血根碱能有效改善大鼠佐剂性关节炎（adjuvant-induced arthritis，AIA）的进展，降低关节炎评分、减轻炎症反应并预防骨与关节损伤。结果：流式细胞术和酶联免疫吸附试验（ELISA）均证实其抗炎活性，可降低PGE₂、TNF-α、IL-1和IL-6的水平。在来自RA患者的成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA）中，血根碱触发细胞凋亡，伴随细胞内活性氧（ROS）升高、线粒体膜电位丧失和caspase-3激活，并在体外和体内激活Hippo/YAP通路。讨论：这些结果表明，血根碱通过激活Hippo-YAP/TAZ通路诱导凋亡并抑制炎症，从而改善RA，凸显其作为RA新型治疗候选药物的潜力。

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以持续性炎症性滑膜炎为特征的慢性系统性自身免疫病，可导致进行性身体残疾、死亡率增加和重大社会经济负担。目前RA尚无治愈方法，传统非甾体抗炎药、糖皮质激素和改善病情抗风湿药逐渐转向针对肿瘤坏死因子α（TNF-α）、环氧化酶（COX）和白介素（IL）信号通路的生物制剂。尽管这些靶向药物能缓解疼痛和抑制炎症，但存在医疗费用高、免疫相关不良事件及长期免疫抑制导致的心血管并发症、胃肠道溃疡和感染等严重副作用。因此，亟需更安全、更经济的治疗药物。中药在亚洲治疗关节疾病有数千年历史。血根碱（sanguinarine）是从白屈菜、紫堇、血水草和博落回等中药植物中提取的生物碱，具有广谱抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和促凋亡活性，但其在RA成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）中是否发挥作用及机制尚不清楚。Hippo-YAP信号通路主要调控胚胎发育、细胞凋亡、细胞分化和器官大小，在RA中的研究不足。既往研究表明YAP/TAZ在关节炎中具有转录活性，Hippo-YAP/TAZ级联异常激活会破坏关节软骨稳态，但其在关节炎发病中的确切作用及血根碱是否通过该通路发挥作用仍不清楚。研究人员利用佐剂性关节炎（adjuvant-induced arthritis，AIA）大鼠模型和人RA成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA）阐明血根碱通过激活Hippo-YAP/TAZ通路诱导凋亡并抑制炎症，为RA治疗提供了新机制和新候选药物。

研究人员采用购自Charles River的SD大鼠建立完全弗氏佐剂（Complete Freund’s Adjuvant，CFA）诱导的AIA模型，并以购自ATCC的HFLS-RA细胞系作为体外模型。主要关键技术包括：关节炎评分与足容积测量、X-ray和micro-CT成像、苏木精-伊红（H&E）染色和番红O染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术、TUNEL染色、JC-1线粒体膜电位检测、DCFH-DA活性氧（ROS）检测、Transwell迁移/侵袭实验、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western blot、免疫荧光、免疫组织化学（IHC），以及MST1 siRNA和ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）的拯救实验。研究分为正常对照组、AIA模型组、甲氨蝶呤阳性对照组和2.5、5、10 mg/kg血根碱治疗组，连续给药30天。

**血根碱抑制佐剂性关节炎中的炎症和骨侵蚀**：在AIA大鼠模型中，血根碱治疗呈剂量依赖性地降低关节炎评分、减少后爪肿胀，并减轻骨和关节破坏；5 mg/kg血根碱的治疗效果与甲氨蝶呤相当。H&E和番红O染色显示血根碱保留关节软骨结构并减少炎性浸润。

**血根碱通过抑制炎症反应和滑膜细胞凋亡减轻佐剂性关节炎**：器官指数分析显示血根碱可减轻模型大鼠脾肿大，且对胸腺和肝脏无明显毒性。ELISA检测显示血根碱显著降低血清TNF-α、IL-1β、PGE₂和IL-6水平；TUNEL染色和caspase-3活性检测显示血根碱增加关节滑膜细胞凋亡。

**血根碱在HFLS-RA细胞中触发细胞死亡并减轻促炎激活**：MTT法和乳酸脱氢酶（LDH）释放实验显示血根碱呈剂量依赖性降低细胞活力并增加细胞毒性；Transwell实验显示血根碱抑制HFLS-RA细胞迁移和侵袭；qRT-PCR显示血根碱下调IL-1和IL-6 mRNA表达。

**血根碱处理在HFLS-RA细胞系中触发细胞凋亡**：TUNEL染色、流式细胞术和caspase-3活性检测均证实血根碱诱导细胞凋亡；Western blot显示Bax/Bcl-2比值升高。JC-1检测显示血根碱导致线粒体膜电位（Δψm）下降，DCFH-DA探针检测显示细胞内ROS水平呈剂量和时间依赖性升高。

**血根碱通过调控Hippo-YAP/TAZ信号级联减轻类风湿关节炎**：Western blot显示血根碱呈时间和剂量依赖性增加MST1/2、LATS1/2、YAP和TAZ的磷酸化；免疫荧光显示血根碱减少YAP和TAZ的核定位，促进其胞质滞留。使用MST1/2抑制剂XMU-MP-1或MST1 siRNA可阻断血根碱诱导的凋亡并逆转其对IL-1和IL-6的抑制作用，表明MST1/2是血根碱治疗效应的关键介质。

**ROS清除剂逆转血根碱的保护表型及其激活Hippo信号的能力**：NAC预处理可有效清除血根碱诱导的ROS、恢复线粒体膜电位、阻断细胞凋亡和caspase-3激活，并逆转血根碱对Hippo通路的激活作用，证明ROS升高是血根碱诱导凋亡和激活Hippo通路的关键上游驱动因素。

**Hippo-YAP/TAZ信号通路参与血根碱体内抗关节炎效应**：在AIA大鼠关节组织免疫组织化学染色中，血根碱治疗显著增加MST1/2、LATS1/2、YAP和TAZ的磷酸化水平，而在模型组中这些磷酸化水平降低，证实血根碱在体内通过调控Hippo-YAP/TAZ通路改善RA病理。

讨论部分指出，RA目前缺乏有效改善疾病的疗法，中药通过多靶点机制缓解症状。血根碱具有多种生物活性，但其抗关节炎作用及分子基础此前尚不清楚。AIA模型因操作简单、炎症发生快，适用于抗炎药物初筛；该研究首次在CFA诱导的AIA大鼠模型中评估血根碱的抗关节炎作用。氧化应激和促炎细胞因子是RA发病的关键因素，血根碱通过破坏Δψm和诱导ROS产生发挥促凋亡作用。Hippo通路通过多种机制参与RA发病，YAP可促进滑膜血管生成、炎症因子产生并调节FLS自噬和迁移，MST1可被氧化应激激活并诱导线粒体功能障碍和细胞凋亡。NAC清除ROS可消除血根碱对Hippo通路的激活，进一步表明ROS是Hippo-YAP/TAZ轴的上游调控因子。研究结论为：血根碱通过靶向Hippo-YAP/TAZ通路，调节促凋亡和抗炎效应，从而发挥抗关节炎作用，为其治疗RA提供了机制基础。