《Frontiers in Microbiology》：Inhibitory effects of propyl paraben, citral, and gallic acid on the growth, patulin biosynthesis, and patulin biosynthetic gene expression of Penicillium paneum OM1
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摘要：潘尼青霉（Penicillium paneum）是一种植物病原真菌，可引起梨果腐烂并在梨中产生棒曲霉素（patulin）。目前关于食品级天然化合物对P. paneum生长及其产棒曲霉素的抑制作用的资料十分有限。本研究评估了尼泊金丙酯（propyl par
摘要：潘尼青霉（Penicillium paneum）是一种植物病原真菌，可引起梨果腐烂并在梨中产生棒曲霉素（patulin）。目前关于食品级天然化合物对P. paneum生长及其产棒曲霉素的抑制作用的资料十分有限。本研究评估了尼泊金丙酯（propyl paraben）、柠檬醛（citral）和没食子酸（gallic acid）对P. paneum OM1在YES培养基（棒曲霉素支持培养基）上积累棒曲霉素及其生长的影响。结果表明，25 μg/mL尼泊金丙酯或400 μg/mL柠檬醛可将该菌的棒曲霉素产量抑制至检测限以下，而在相同浓度下，其生长分别被抑制14.5%和42.8%。然而，没食子酸在100–500 μg/mL范围内不影响该真菌菌株的生长，但在25 °C培养7天后可将其棒曲霉素产量抑制32.9%–37.8%。此外，研究人员评估了各化合物处理下P. paneum OM1中5个关键棒曲霉素生物合成基因的表达情况。结果显示，除没食子酸处理下的patE外，patK、patL、patN、patG和patE在P. paneum OM1中的表达均被下调。进一步地，在半个梨上施用0.25 μg尼泊金丙酯后，P. paneum OM1产生的棒曲霉素未被检出，且病斑面积减少57%。上述数据表明，低浓度尼泊金丙酯对P. paneum OM1在梨上的生长及其棒曲霉素产生具有强抑制作用。该研究结果为利用食品级天然化合物作为抗真菌和抗真菌毒素剂，从而预防P. paneum OM1污染梨果中的棒曲霉素提供了新见解。
论文解读
棒曲霉素（patulin）是一种由多种青霉属和曲霉属真菌产生的多酮类真菌毒素，具有神经毒性、遗传毒性、致畸性和致癌性，可污染梨、苹果等蔷薇科水果及其加工制品。潘尼青霉（Penicillium paneum）是引起梨果青霉腐烂病的主要病原真菌之一，部分菌株在侵染果实的同时还能积累棒曲霉素，对消费者健康构成潜在威胁。传统的采后病害防控主要依赖合成杀菌剂，但病原菌抗药性的出现、果实上化学残留的毒性以及环境安全问题，促使研究者寻求安全、环境友好且高效的天然抗真菌和抗真菌毒素化合物。已有的研究表明，植物源天然产物如对羟基苯甲酸（pHBA）及其衍生物、柠檬醛（citral）和没食子酸（gallic acid）对多种产毒真菌具有抑制活性，但这些化合物对P. paneum生长及其棒曲霉素合成的影响尚缺乏系统研究。因此，本研究选用3种被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为一般公认安全（GRAS）的食品级天然化合物——尼泊尔金丙酯（propyl paraben，pHBA的正丙酯）、柠檬醛和没食子酸，评估它们对P. paneum OM1（从韩国‘新高’梨品种中分离的产棒曲霉素菌株）在YES培养基和梨果实上的生长、棒曲霉素积累以及棒曲霉素生物合成基因表达的影响，旨在为采后梨果棒曲霉素污染防控提供新策略。
研究人员采用体外培养结合果实活体接种的方法开展实验。在YES培养基上分别添加3种不同浓度的尼泊金丙酯（10、25、50 μg/mL）、柠檬醛（100、200、400 μg/mL）和没食子酸（100、250、500 μg/mL），并于25 °C培养7天，测定菌落直径、菌丝干重及棒曲霉素产量；随后利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析5个关键棒曲霉素生物合成基因（patK、patL、patN、patG和patE）的相对表达水平。在梨果实实验中，将P. paneum OM1孢子悬液接种于经表面消毒的半个梨（‘新高’品种）中央孔洞内，同时施加0.1或0.25 μg尼泊金丙酯，25 °C培养6天后测定病斑直径和棒曲霉素积累量。棒曲霉素提取采用改良的AOAC 995.10官方方法，以高效液相色谱-紫外检测器（HPLC-UVD）在276 nm波长下定量，并通过加标回收率、检测限（LOD）和定量限（LOQ）验证了分析方法的准确性和灵敏度。
研究结果如下：
（1）3种天然化合物对P. paneum OM1产棒曲霉素及其生长的影响。在YES培养基上培养7天后，与对照相比，最高浓度尼泊金丙酯（50 μg/mL）、柠檬醛（400 μg/mL）和没食子酸（500 μg/mL）分别使棒曲霉素产量降低99.9%、100%和37.8%。其中，25 μg/mL尼泊金丙酯和400 μg/mL柠檬醛处理使棒曲霉素完全低于检测限。在生长抑制方面，尼泊金丙酯和柠檬醛呈剂量依赖性抑制菌落直径和菌丝干重，最高浓度下菌落直径分别减少33.1%和42.8%，菌丝干重分别减少36.7%和54.3%；没食子酸在100–500 μg/mL范围内对菌落直径和菌丝干重均无显著影响，但能稳定抑制棒曲霉素积累32.9%–37.8%。
（2）3种天然化合物对P. paneum OM1中棒曲霉素生物合成基因表达的影响。在含有10 μg/mL尼泊金丙酯、200 μg/mL柠檬醛或100 μg/mL没食子酸的YES培养基上培养3天和6天后，RT-qPCR分析显示，除没食子酸处理组的patE外，各处理组中patK、patL、patN、patG和patE的表达水平在培养第3天和第6天均低于对照。其中，尼泊金丙酯处理组总体上表现出略低的基因表达水平。与基因表达趋势一致，处理后第6天，尼泊金丙酯、柠檬醛和没食子酸分别使棒曲霉素产量降低约73%、42%和10%。这表明天然化合物通过下调棒曲霉素生物合成基因的转录水平来抑制棒曲霉素合成，而没食子酸对patE表达无抑制作用可能与其对棒曲霉素抑制效率较低有关。
（3）尼泊金丙酯对梨果实上P. paneum OM1生长和产毒的影响。在人工接种P. paneum OM1的梨果上施用0.25 μg尼泊金丙酯后，病斑面积比对照减少57%，平均直径从1.05 cm降至0.7 cm，平均病斑面积从0.88 cm2降至0.38 cm2；同时，该处理使梨中棒曲霉素含量低于检测限（LOD=0.038 μg/mL，LOQ=0.116 μg/mL）。施用0.1 μg尼泊金丙酯时，棒曲霉素产量比对照减少70%。梨样品的加标回收率为75.38%–81.12%，符合欧盟官方分析方法的回收率要求，表明检测结果可靠。
讨论与结论：本研究首次报道了食品级GRAS天然化合物对P. paneum菌株生长及棒曲霉素合成的抑制作用。尼泊金丙酯和柠檬醛以剂量依赖方式显著抑制P. paneum OM1的生长和棒曲霉素产生，且尼泊金丙酯在极低浓度下即可完全抑制梨果实上的棒曲霉素积累；没食子酸虽不影响该菌生长，但能通过下调棒曲霉素生物合成基因表达而减少棒曲霉素产量。这些抑制作用可能涉及细胞内活性氧（ROS）水平改变、麦角甾醇合成干扰或细胞分裂受阻等机制，但具体分子途径有待进一步研究。该研究为利用天然、安全的抗真菌和抗真菌毒素化合物预防梨果采后棒曲霉素污染提供了新思路，尼泊金丙酯和柠檬醛有望作为果实采后病害绿色防控的候选制剂。未来研究应聚焦于阐明这些天然化合物调控P. paneum OM1中棒曲霉素生物合成基因表达的具体信号通路。
