《Animal Research and One Health》：Cumulative Reproductive-Lactation Burdens Induce a Systemic Immunometabolic Trade-Off Between Milk Yield and Mammary Health of Dairy Cows
编辑推荐：
持续泌乳与重复性繁殖周期对奶牛施加了持续的生理需求与累积性系统应激。然而，循环血液特征如何适应累积性繁殖与泌乳负荷，以在维持产奶量的同时保护乳腺健康，其分子机制仍知之甚少。本研究对191头荷斯坦奶牛（胎次1至9）在四个生理阶段（干奶期、泌乳早期、中期和晚期）的
持续泌乳与重复性繁殖周期对奶牛施加了持续的生理需求与累积性系统应激。然而，循环血液特征如何适应累积性繁殖与泌乳负荷，以在维持产奶量的同时保护乳腺健康，其分子机制仍知之甚少。本研究对191头荷斯坦奶牛（胎次1至9）在四个生理阶段（干奶期、泌乳早期、中期和晚期）的外周血转录组进行了测序，旨在表征由泌乳阶段和累积性繁殖负荷调控的免疫代谢适应。表型分析显示，高胎次奶牛产奶量更高，而繁殖周期的渐进累积导致体细胞评分升高及乳腺炎风险增加。在整个泌乳阶段，低胎次（LP）与高胎次（HP）老龄奶牛之间观察到显著的转录组差异，其中49个免疫相关差异表达基因（DEGs）在各阶段持续检出。功能富集分析显示，LP奶牛在核糖体生物发生、RNA剪接和DNA修复相关通路中表现出一致性上调，而HP奶牛在IL-17、NF-κB、细胞衰老及线粒体氧化应激相关通路中表现出持续性激活。加权基因共表达网络分析（WGCNA）与纵向轨迹聚类揭示了LP与HP组间差异化的基因模块调控网络。单细胞转录组反卷积进一步表明，繁殖负荷的增加与外周免疫细胞组成的重塑相关，其特征为T细胞比例降低、嗜酸性粒细胞和NKT细胞比例升高，以及非经典单核细胞的阶段特异性变化。综上所述，这些发现表明，反复的泌乳与繁殖应激驱动系统性免疫代谢重编程及循环免疫细胞重塑，最终导致产奶性能与乳腺免疫稳态之间的生理性权衡。该群体规模转录组资源为集约化奶牛养殖系统中生产长寿性的分子基础提供了新的机制见解。
一、研究背景与科学问题
泌乳是奶牛生理需求最为旺盛的时期之一。从妊娠后期到泌乳早期的转变会引发全身代谢、内分泌调控、免疫稳态及组织程序的广泛重组。在产奶高峰期，能量需求可超出维持水平的数倍，导致营养物质快速再分配以及代谢与免疫网络的协同调控。尽管这些适应支持了高泌乳量，但同时也增加了负能量平衡、氧化与炎症应激、矿物质失衡以及乳腺炎、子宫炎和酮病等疾病的发生风险。然而，目前关于这些适应在群体水平上的系统性分子机制仍知之甚少，尤其是免疫与代谢程序在泌乳周期中如何在循环系统中被重塑，以及这些轨迹在不同胎次奶牛间是否存在差异。
现有关于奶牛泌乳周期的转录组研究在范围、深度和代表性方面均存在局限。小规模的组织特异性纵向研究虽揭示了瘤胃、十二指肠和结肠中营养吸收、免疫信号及细胞过程相关机制的阶段性重塑，但这些发现受限于特定组织且缺乏群体水平验证。基于血液的转录组研究虽已鉴定出脂质代谢、免疫通路和激素调控的显著阶段依赖性变化，但多数研究局限于初产牛、小样本量或有限的时间点。胎次作为反映生理年龄、繁殖史和组织修复能力的生物学分层因素，很可能塑造不同的泌乳适应轨迹。然而，迄今尚无系统性血液转录组研究整合群体规模分析、全周期覆盖以及对胎次效应的明确解析。
与此同时，家畜功能基因组资源的快速扩展为解析复杂性状的分子基础开辟了新途径。大规模多组织转录组数据集如FarmGTEx已建立了全面的基因表达图谱，并将表达数量性状基因座（eQTLs）与重要经济性状相关联。单细胞RNA测序技术实现了更高的细胞分辨率，能够精细解析细胞群体、调控程序及组织间细胞通讯。然而，由于批量RNA测序将来自所有组成细胞的信号聚合为单一读数，难以区分细胞组成变化与特定细胞类型的内在转录调控，这一挑战在细胞景观高度动态的泌乳背景下尤为突出。反卷积方法虽在人类研究中显示出较大应用价值，但在家畜科学中仍处于起步阶段。
为应对上述局限，研究人员构建了191头荷斯坦奶牛的外周血转录组数据集，覆盖干奶期及泌乳早、中、晚期，胎次范围为1至9。通过整合无监督聚类、功能富集分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）信息引导的细胞反卷积，研究人员旨在区分阶段驱动的分子重塑与胎次相关的生物学分化，系统解析累积性繁殖负荷对奶牛免疫代谢适应轨迹的影响及其分子机制。
二、主要技术方法
研究人员从江苏省奶牛生产性能测定（DHI）中心约10,000头中国荷斯坦奶牛群体中筛选出191头具有完整DHI记录的健康经产奶牛（胎次1至9），采集尾静脉血进行批量RNA测序。同时，选取一头低胎次牛和一头高胎次牛的外周血样本进行单细胞RNA测序，构建细胞类型参考矩阵。主要分析手段包括：DESeq2差异表达分析、Gene Ontology（GO）与KEGG通路富集分析、WGCNA共表达网络构建、Mfuzz软聚类纵向轨迹分析、HOMER顺式调控基序富集分析，以及基于阻尼加权最小二乘法（DWLS）的批量转录组细胞类型反卷积。
三、研究结果
3.1 泌乳阶段与胎次相关的表型变异
产奶量在个体间差异显著，平均为36.76 kg，变异系数约30%。体细胞评分（SCS）在所有性状中离散度最大（变异系数>80%），反映乳房健康与炎症状态的高度变异性。泌乳早期乳脂率显著低于干奶期；SCS呈非线性变化模式，在泌乳中期降至最低点，随后在过渡期和泌乳晚期回升。按胎次分析，经产牛产奶量显著高于初产牛，且随着胎次推进，SCS呈进行性升高，提示老龄奶牛面临更大的乳房健康挑战。
3.2 泌乳阶段间的转录组特征
主成分分析沿第一主成分（解释38.48%方差）将高胎次（HP）与低胎次（LP）样本分离。LP-HP差异表达基因（DEGs）数量从干奶期到泌乳晚期逐步减少。干奶期共鉴定1367个DEGs，富集于炎症反应、细胞迁移、细胞因子-细胞因子受体互作及补体和凝血级联通路。泌乳早期鉴定1229个DEGs，富集于趋化因子信号、中性粒细胞趋化、TNF和IL-17信号通路。泌乳中期鉴定1185个DEGs，与趋化因子驱动的白细胞迁移、抗微生物体液免疫及感染/炎症性疾病通路相关。泌乳晚期鉴定896个DEGs，富集转向丝氨酸型肽酶/水解酶活性，仅保留两个炎症性KEGG通路，提示免疫信号减弱及功能转变。各阶段共有49个免疫相关核心DEGs持续富集，表明存在胎次驱动的持续性免疫学基线。
3.3 泌乳期间阶段特异性表达模式
LP奶牛中鉴定出2751个阶段特异性基因，干奶期富集于核糖核蛋白生物发生和翻译调控等生物合成准备通路，泌乳开始后持续激活RNA剪接、核糖体生物发生和核质转运通路，反映高强度的持续生物合成需求。HP奶牛中鉴定出2957个阶段特异性基因，功能特征截然不同。泌乳早中期以C型凝集素受体信号、细胞衰老和IL-17信号为特征，泌乳晚期呈现NF-κB激活，表明老龄奶牛在整个周期中表现出更强的应激和免疫特征。
3.4 时间动态的聚类与预测调控网络
层级聚类显示两组奶牛在泌乳周期中均存在保守的时间激活模式。然而，转录因子（TF）富集分析揭示了差异化的上游调控网络。LP奶牛中预测调控因子富集于发育信号、代谢调节和细胞周期调控相关因子，包括HOXA4、ELK1和YY1；HP奶牛中则富集于分化、应激响应和免疫防御相关因子，包括RUNX2、ZNF382和HNF4A相关因子，提示随着胎次推进存在调控优先级的转变。
3.5 共表达基因网络分析
WGCNA结果显示，LP奶牛呈现从干奶期基础免疫激活到泌乳早期单一免疫中心模块，再到泌乳中晚期广泛RNA加工和翻译网络的紧密耦合模块。HP奶牛模块更为碎片化且偏向防御导向：产犊前以活性氧（ROS）代谢和抗菌反应为主，产奶高峰期富集T细胞调控和中性粒细胞募集，泌乳晚期以免疫球蛋白产生为终点。
3.6 胎次依赖性基因簇
对16,779个表达基因的纵向聚类鉴定出10个稳健轨迹。C1和C2簇在HP奶牛中持续高表达，富集于白细胞介导免疫、抗原呈递和线粒体氧化磷酸化。C8和C10簇在LP奶牛中表达升高，富集于DNA修复、染色体分离和mRNA加工。
3.7 胎次与泌乳阶段的免疫细胞组成模式
基于单细胞参考矩阵的反卷积分析显示，HP奶牛推断的嗜碱性粒细胞和T细胞比例显著降低，而嗜酸性粒细胞和自然杀伤T（NKT）细胞比例显著升高。时间维度上，嗜碱性粒细胞和非经典单核细胞表现出显著的阶段特异性变化。
四、讨论与结论
本研究建立了覆盖奶牛泌乳全周期的群体规模外周血转录组图谱。干奶期至泌乳早期的转变是系统性转录组重塑最显著的拐点，大量DEGs及白细胞迁移、细胞因子信号、补体激活和趋化因子驱动通路的强富集表明分娩前后存在广泛的免疫重编程。泌乳中晚期则转向更聚焦的功能特化程序，反映从产后急性炎症向免疫调节、组织重塑和上皮完整性维持的转变。
胎次是生物学分化的主要轴线。LP奶牛优先富集细胞周期控制、DNA修复、RNA加工和染色质相关程序，提示年轻动物保留更强的细胞维护和修复能力。HP奶牛则表现出免疫防御、氧化应激反应和线粒体能量通路的更强激活，与反复繁殖和泌乳周期施加的累积生理需求一致。衰老、NF-κB、IL-17和C型凝集素受体通路的增强富集提示老龄奶牛存在免疫监视增强和慢性低度炎症。
WGCNA揭示了胎次依赖的网络架构差异：LP奶牛在核糖体组装、RNA生物合成和炎症通路间表现出更强的耦合，反映能量灵活的转录响应；HP奶牛激活的模块则与ROS代谢、抗菌肽、中性粒细胞趋化和蛋白质分解代谢相关，表明老龄奶牛更依赖应激反应和免疫效应程序。
转录因子分析进一步阐明了这些分化的调控基础。反卷积分析表明，胎次相关的转录组差异伴随可测量的循环免疫细胞组成变化，HP奶牛中嗜酸性粒细胞和NKT细胞比例升高、嗜碱性粒细胞和T细胞比例降低，与先天免疫优势增强和适应性免疫能力下降的趋势一致。
结论：本研究建立了泌乳周期血液的高分辨率分子图谱，揭示了跨越免疫、代谢和细胞通路的阶段特异性和胎次依赖性适应。高胎次奶牛表现出更强的免疫防御、炎症和氧化应激程序，而低胎次奶牛则表现出更强的增殖、DNA修复和RNA加工程序。这些发现为理解不同胎次间的生产与健康差异提供了分子框架。未来研究方向包括：整合血液特征与乳腺、肝脏、脂肪组织和生殖道转录组以定义协调泌乳的系统性调控轴；对关键模块和枢纽基因进行功能验证以作为预测疾病风险、产奶量恢复力和代谢紊乱的早期预警生物标志物；整合eQTL、单细胞eQTL和基因组选择数据集以鉴定调控阶段特异性和胎次驱动响应的调控变异，为泌乳稳健性的精准育种提供直接应用价值。
