骨相关宿主细胞模型内化实验中改善细胞外葡萄球菌清除的方法学策略

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：A methodological approach to improve extracellular staphylococcal clearance in internalization assays using bone-associated host-cell models of orthopedic infections

　　

骨科植入物相关感染是假体失败的主要原因，并与生物膜形成、抗菌药物耐受和细菌持续存在相关。细菌内化到骨相关宿主细胞中也可能导致慢性或复发性感染。然而，非标准化的细胞外细菌清除、感染复数（multiplicity of infection, MOI）的定义以及数据归一化限制了实验的解释和可比性。本研究旨在建立一种逐步方案，通过识别和预防主要方法学陷阱，获得细胞外葡萄球菌清除，从而实现对宿主细胞内化细菌的无偏定量。宿主细胞裂解液中的细胞相关细菌作为次要终点。以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）USA300和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）RP62A为模型病原体，以MG-63骨肉瘤细胞和人骨髓间充质基质细胞（human bone-marrow mesenchymal stromal cells, hBM-MSCs）为宿主细胞模型。首先在无宿主细胞条件下，用模拟MOI为50和100的细菌接种物评估万古霉素和溶菌酶。在较低接种物下清除更有效且更一致。因此，在MOI为50感染2小时后，单独或序贯测试了25 μg/mL溶菌酶30分钟和100 μg/mL万古霉素60分钟。单独使用万古霉素导致最高的残留细胞外细菌回收，妨碍了对细胞裂解液中菌落形成单位（colony-forming units, CFU）的解读。含溶菌酶的方案将最终处理培养基中回收的活CFU降至接近或低于检测限。含溶菌酶处理后，从细胞裂解液中回收的表皮葡萄球菌可忽略不计。相差显微镜监测宿主细胞形态，而共聚焦显微镜支持细胞内细菌定位。这些发现表明，抗菌治疗应在细菌-宿主细胞系统内进行验证，而不是仅从无细胞试验中选择。该框架整合了菌株特异性抗菌测试、接种物选择、细胞外清除验证、宿主细胞数归一化以及基于显微镜的评估，提高了葡萄球菌与骨相关细胞相互作用的体外研究的严谨性和可比性。

骨科植入物相关感染是假体失败的主要原因，尽管在骨整合和抗菌药物研究方面不断取得进展，但葡萄球菌仍可通过生物膜形成和细胞内化两种互补策略逃避抗生素和宿主防御。生物膜中的细菌呈缓慢生长或代谢改变状态，导致感染难以诊断且对全身抗生素治疗反应差；而细菌内化到骨相关宿主细胞（如成骨细胞、骨髓间充质基质细胞）中，可逃避免疫系统和常规抗生素，成为慢性或复发性感染的潜在储库。然而，目前关于葡萄球菌内化的体外研究方法缺乏标准化，主要体现在感染复数（multiplicity of infection, MOI）的定义不统一（常以铺板时细胞数而非感染时实际细胞数计算）、细胞外细菌清除方案各异、菌落形成单位（colony-forming units, CFU）的归一化方式混乱，且多数研究未独立验证细胞外细菌是否被完全清除，仅依赖文献中的抗生素有效性证据。这些不一致严重阻碍了不同研究间的可比性和可重复性，因此亟需建立一套经过系统验证的细胞外清除方案，以确保从细胞裂解液中回收的细菌确实代表内化细菌。

为解决上述问题，研究人员以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）USA300和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis, S. epidermidis）RP62A为模型病原体，以MG-63骨肉瘤细胞系和来自三个供体混合的人骨髓间充质基质细胞（hBM-MSCs）为宿主细胞模型，开展了一项系统的方法学验证研究。首先通过生长曲线和OD₆₀₀-CFU校准确定感染用细菌的指数生长期和标准接种密度；随后在无宿主细胞条件下模拟MOI 100和50，评估万古霉素和溶菌酶在不同浓度和暴露时间下的清除效果；最后将候选方案应用于细菌-宿主细胞共培养，通过回收最终处理培养基中的残留细菌、细胞裂解液中的细胞相关CFU以及共聚焦显微镜验证细胞内定位，建立了完整的内化实验流程。

在方法学层面，研究人员运用了多项关键技术。细菌方面，采用Vitek2系统进行抗菌药物敏感性试验，通过生长曲线确定3小时为对数中期（T3），并建立OD₆₀₀与CFU/mL的换算关系以实现接种物的标准化。细胞外清除试验在无细胞体系中模拟两种MOI，筛选溶菌酶（10、25、50 μg/mL）和万古霉素（50、100 μg/mL）分别在30分钟和60分钟的效果。随后在MG-63和hBM-MSCs中进行2小时感染，感染后分别采用溶菌酶单独、万古霉素单独、溶菌酶→万古霉素（L+V）、万古霉素→溶菌酶（V+L）四种处理，通过差速离心和裂解回收细菌。免疫染色结合共聚焦激光扫描显微镜，使用物种特异性抗体和麦胚凝集素标记细胞膜，进行三维重构以确认细菌的细胞内定位。所有数据在log₁₀尺度上进行分析，并针对不同数据分布采用参数或非参数检验。

主要结果分三部分呈现。第一，细菌抗生素耐药性、生长动力学和OD₆₀₀-CFU校准：药敏试验显示S. epidermidis对青霉素、庆大霉素、红霉素、利奈唑胺和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑耐药，而S. aureus对青霉素和红霉素耐药；鉴于S. epidermidis对庆大霉素耐药，选择万古霉素和溶菌酶作为清除剂。两种菌株在BHI培养基中生长趋势相似，T3处于指数生长期；通过OD₆₀₀回归确定了感染接种物的标准光密度值（S. aureus为0.55，S. epidermidis为0.60），分别对应1.33 × 10⁸和2.5 × 10⁸ CFU/mL。第二，无细胞细菌清除试验的优化：在模拟MOI 100条件下，万古霉素能将两种菌株降至约5.5–5.8 log₁₀ CFU，但未完全清除；溶菌酶对S. aureus的清除接近完全（存活率约0%），对S. epidermidis则仅部分清除（存活率约20–30%）。将模拟MOI降至50后，万古霉素和溶菌酶的清除效果均更为一致，且溶菌酶对S. aureus的活性显著优于S. epidermidis。综合动态范围，选择MOI 50进行后续细胞试验，并选用25 μg/mL溶菌酶30分钟和100 μg/mL万古霉素60分钟作为处理条件。第三，转化为基于细胞的内化试验：在S. aureus感染中，万古霉素单独处理在两种细胞中均留下最高残留细胞外细菌（hBM-MSCs中未达显著差异，MG-63中显著高于其他处理），而含溶菌酶方案均将细胞外细菌降至接近或低于检测限；细胞相关CFU在万古霉素单独处理时数值最高，MG-63中含溶菌酶方案显著降低，其中V+L组合最低。在S. epidermidis感染中，万古霉素单独处理同样产生最高的细胞外和细胞相关回收，含溶菌酶方案使细胞外细菌降至不可检测，细胞相关CFU接近或低于检测限。共聚焦显微镜显示，S. aureus处理的细胞中绿色荧光信号大量位于WGA标记的宿主细胞体积内，并在核周聚集；而S. epidermidis的信号稀疏且多为细胞外小点，仅在少数细胞中观察到胞内信号。未处理对照中细菌分布范围更广，包括表面附着和细胞外信号。

讨论部分强调，抗菌清除处理必须在完整的细菌-宿主细胞系统中验证，因为无细胞试验的结果并不能直接预测细胞环境中的清除效率。万古霉素单独使用无法充分清除细胞外细菌，导致细胞裂解液中的CFU可能被细胞外粘附菌污染，不能可靠解读为内化细菌。而含溶菌酶方案能有效清除细胞外菌，尽管不同溶菌酶方案间的细胞相关CFU差异可能受处理总时间不均衡的影响。宿主细胞类型（MG-63 vs. hBM-MSCs）和菌株特性（S. aureus vs. S. epidermidis）均可影响结果，因此任何系统改变后都需要重新验证。研究局限包括单菌株、缺乏处理后细胞活力和计数测定、仅单一时间点等。研究结论指出，该工作的主要贡献是提出一个验证框架，而非放之四海而皆准的固定方案：候选抗菌处理应先在确定的细菌负荷下筛选，再在相关细菌-宿主细胞模型中验证；细胞外清除、宿主细胞保护以及细胞相关群体的回收应作为独立的方法学终点。在测试条件下，溶菌酶为基础的处理优于万古霉素单独使用，但细菌种类、宿主细胞模型、MOI、处理时长和洗涤程序均需随实验系统的改变而重新验证。这一框架提高了体外研究葡萄球菌与骨相关细胞相互作用的严谨性和可比性，也为其他宿主-病原体相互作用研究提供了借鉴。