《Translational Oncology》：The inflammatory UPR-IFNG axis reveals LBP as a survival and immunotherapy-response marker in hepatocellular carcinoma
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以下为论文摘要的专业术语翻译：
**炎症性UPR-IFNG轴揭示LBP可作为肝细胞癌生存及免疫治疗反应的标志物**
- LBP可预测肝细胞癌的生存结局。
- UPR-IFNG轴与LIHC中LBP的表达相关。
- LBP可根据免疫浸润模式对患者进行分层。
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以下为论文摘要的专业术语翻译：
**炎症性UPR-IFNG轴揭示LBP可作为肝细胞癌生存及免疫治疗反应的标志物**
- LBP可预测肝细胞癌的生存结局。
- UPR-IFNG轴与LIHC中LBP的表达相关。
- LBP可根据免疫浸润模式对患者进行分层。
- LBP可能预示LIHC对免疫治疗的反应。
**引言**
肝细胞癌（LIHC）的精准医疗日益受到多组学生物标志物发现的推动，然而临床预后仍受到高度肿瘤异质性和免疫检查点阻断（ICB）低客观缓解率的阻碍。尽管高通量测序已产生海量数据集，但原始多组学数据与可操作的临床效用证据之间的转化差距仍是关键瓶颈。当前，迫切需要识别稳健的预后生物标志物和可靠的免疫治疗反应预测因子，以优化LIHC患者分层并指导精准治疗。解决这一问题需要稳健的分析流程，能够将复杂的转录组景观提炼为标准化的临床靶标。
未折叠蛋白反应（UPR）是复杂生物网络的一个典型例子，需要先进的多组学解析。作为一种进化上保守的细胞应激反应，UPR维持内质网（ER）稳态。在肿瘤学中，持续的UPR激活驱动恶性增殖、代谢重编程和治疗耐药。至关重要的是，新兴证据表明UPR可动态重塑肿瘤免疫微环境（TME）并介导LIHC的免疫治疗耐药。然而，定义UPR相关特征的临床检测标准一直颇具挑战。UPR相关特征的综合分子特征尚未在细胞类型特异性水平上得到完全解析，因此需要整合单细胞分辨率转录组数据以剖析高度异质性LIHC TME中的UPR特征。
作为抗肿瘤适应性免疫的核心效应细胞因子，干扰素-γ（IFNG）不仅驱动CD8+ T细胞的细胞毒功能并塑造炎症性TME状态，还通过触发内质网应激与ER应激形成双向串扰。尽管ER应激和IFNG的作用已明确，但UPR与IFNG之间的分子联系及其共享的下游效应基因在LIHC中尚未得到系统表征。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）通过以前所未有的分辨率实现细胞组成、细胞类型特异性基因表达模式和细胞间相互作用的无偏解析，革新了生物标志物图谱绘制。为利用该技术实现临床转化，研究人员构建了一个整合的多组学流程，将大规模scRNA-seq数据集与批量RNA-seq队列相结合，以系统探索UPR相关的转录组景观。该方法通过采用先进算法构建UPR相关分子亚型，应对生物标志物发现中的计算挑战。研究人员选择随机生存森林和CoxBoost进行特征选择，因为这些模型能够捕获非线性生存相关模式并处理高维转录组数据，补充了LASSO和Ridge回归等传统惩罚线性模型。
通过这一AI驱动的多组学框架，研究人员通过生物信息学和机器学习鉴定了核心预后基因脂多糖结合蛋白（LBP）。研究人员进一步研究了其功能相关性、与免疫TME特征的相关性及其对免疫治疗反应的预测价值。通过将单细胞生物标志物图谱绘制与稳健的机器学习验证相结合，本研究旨在为LIHC患者的预后评估和免疫治疗分层提供新型UPR相关生物标志物，提供可操作的效用证据，以弥合多组学发现与精准肿瘤免疫调节之间的差距。
**材料与方法**
**数据集收集**
整合了三个scRNA-seq数据集：GSE149614、GSE189903和GSE245906。共处理了278,337个细胞，使用Seurat R包。归一化和可变特征选择后，进行主成分分析，并使用30个主成分以0.8的分辨率进行聚类。采用Harmony算法处理跨样本异质性。收集了LIHC批量RNA测序数据集，包括TCGA队列、GSE116174队列、GSE144269队列和GSE14520队列。
**WGCNA与IFNG模块选择**
为研究IFNG基因网络，首先从HALLMARK数据库计算IFNG通路。随后进行加权基因共表达网络分析（WGCNA），以寻找与IFNG活性相关性最强的基因模块。选择软阈值7构建无尺度共表达网络。使用minModuleSize=30和mergeCutHeight=0.25进行动态树切割。
**基于UPR的患者聚类与DEG分析**
同时收集了既往研究中的UPR相关基因集。接下来，根据UPR模式对患者进行分组。使用ConsensusClusterPlus结合围绕中心点划分（PAM）算法，成功鉴定了不同的UPR相关聚类。患者分组后，使用limma包检测这些特定UPR相关聚类之间的差异表达基因（DEGs）。
**机器学习基因筛选**
为寻找最有用的预后基因，研究人员考察了三个组间共有的基因：恶性细胞中上调的基因、UPR相关DEGs以及WGCNA turquoise模块基因。这一三重过滤策略旨在保留在恶性上皮细胞中富集、与UPR定义的患者分层相关、并嵌入IFNG相关共表达模块的基因。使用单变量Cox回归评估这些交集基因对患者生存的影响。最后，使用两种机器学习算法——随机生存森林（RSF）和CoxBoost——来选择最优基因。
**功能分析与肿瘤微环境**
为理解LBP的生物学作用，研究人员基于Gene Ontology（GO）通路和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，使用基因集富集分析（GSEA）进行功能注释。进一步评估了肿瘤微环境。使用肿瘤免疫评估资源（TIMER 2.0）评估免疫细胞浸润，并使用ESTIMATE算法估计基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分。此外，探讨了LBP与七类免疫调节因子之间的关系。
**免疫治疗反应预测**
在最后一步中，研究人员测试了LBP是否能预测患者对免疫治疗的反应。为此，分析了其与九个既定标志物的关联：CYT、IFNγIS、ImmuneScore、RIR、ICBnetIS、AyersExpIS、RohIS、DavoliIS和GEP。CYT由细胞溶解效应基因计算得出，ImmuneScore源自ESTIMATE，其余已发表的应答特征根据其原始定义计算。此外，使用BEST平台探索了LBP的免疫治疗预测价值。
**细胞培养与RNA干扰**
研究人员从Cellverse Co., Ltd.获得SNU-387和SNU-398细胞。细胞在含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM中培养，并在37°C、5% CO2的培养箱中维持。为敲低LBP表达，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）将LBP特异性siRNA（si-LBP）或阴性对照（si-NC）转染至细胞。
**体外表型与功能评估**
使用Trizol（Invitrogen）提取总RNA，并进行RT-qPCR以确认敲低效率。GAPDH作为内参，使用2?ΔΔCt方法计算相对LBP表达。使用CCK-8和EdU实验测量细胞增殖。对于CCK-8实验，在96孔板中每孔接种1×103个细胞。在0、24、48和72小时，加入CCK-8试剂孵育2小时，使用Bio-Rad酶标仪读取450 nm处的吸光度。对于EdU实验（Apollo 567 Kit, Ribobio），在24孔板中每孔接种5×10?个细胞，并与50 μM EdU孵育2小时。随后用4%多聚甲醛固定细胞，用0.5% Triton X-100透化，并用Apollo 567和DAPI染色。使用Olympus荧光显微镜采集图像，并通过计数五个随机视野中的EdU阳性细胞计算增殖率。所有实验均包含三个生物学重复。
# 论文解读：炎症性UPR-IFNG轴揭示LBP作为肝细胞癌生存及免疫治疗反应的标志物
## 研究背景与目的
肝细胞癌（LIHC）的精准医疗面临严峻挑战，尽管高通量测序产生了海量多组学数据，但将这些原始数据转化为可操作的临床决策依据仍存在显著瓶颈。免疫检查点阻断（ICB）疗法在LIHC中的客观缓解率较低，缺乏可靠的预后生物标志物和免疫治疗反应预测因子来优化患者分层。未折叠蛋白反应（UPR）作为进化保守的细胞应激反应机制，在内质网（ER）稳态维持中发挥关键作用，其持续激活可驱动恶性肿瘤增殖、代谢重编程和治疗耐药。新近证据表明UPR能动态重塑肿瘤免疫微环境（TME）并介导免疫治疗耐药，但UPR相关特征在细胞类型特异性水平上的综合分子特征尚未得到系统解析。同时，作为抗肿瘤适应性免疫的核心效应细胞因子，干扰素-γ（IFNG）与ER应激之间存在双向串扰，然而UPR与IFNG之间的分子联系及其共享的下游效应基因在LIHC中仍未明确。为此，研究人员整合大规模单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集与批量RNA-seq队列，系统探索UPR相关转录组景观，旨在鉴定新型预后和免疫治疗反应生物标志物。
## 研究方案与技术方法
研究人员整合了三个scRNA-seq数据集（GSE149614、GSE189903、GSE245906），涵盖278,337个细胞，使用Seurat包进行归一化、主成分分析和聚类，采用Harmony算法校正跨样本异质性。LIHC批量RNA测序数据来自TCGA队列、GSE116174、GSE144269和GSE14520队列。研究使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定IFNG相关基因模块，通过ConsensusClusterPlus结合围绕中心点划分算法构建UPR相关分子亚型，应用limma包识别聚类间差异表达基因（DEGs）。在机器学习筛选方面，研究人员采用三重过滤策略——交集恶性细胞上调基因、UPR相关DEGs和WGCNA turquoise模块基因，并运用随机生存森林（RSF）和CoxBoost两种算法进行特征选择。功能分析采用基因集富集分析（GSEA）和KEGG通路富集，利用TIMER 2.0和ESTIMATE算法评估免疫微环境。研究人员通过siRNA介导的基因敲低实验在SNU-387和SNU-398细胞系中进行了体外功能验证，使用CCK-8和EdU实验评估细胞增殖能力。
## 研究结果
**单细胞转录组分析定义了LIHC TME的细胞景观。** 研究人员通过整合三个scRNA-seq数据集，成功注释了LIHC TME中的主要和次要细胞群体，UMAP可视化展示了各细胞群的分布特征，标志基因热图验证了细胞类型注释的准确性，并进一步表征了恶性上皮细胞中上调的基因特征，为后续肿瘤特异性预后基因筛选提供了关键过滤条件。
**WGCNA鉴定出IFNG相关的核心基因模块。** 研究以软阈值七构建无尺度共表达网络，通过层次聚类和动态树切割将基因分为不同共表达模块。模块-性状相关性分析显示turquoise模块与IFNG相关性最强且最显著，基因显著性与模块成员之间存在稳健正相关，确立了turquoise模块作为IFNG相关核心基因模块用于下游分析。
**共识聚类鉴定具有不同临床结局的UPR相关分子亚型。** 基于UPR相关基因表达谱，TCGA-LIHC患者被分为两个不同的UPR相关聚类。临床特征分布热图显示两聚类间存在显著临床病理特征差异，主成分分析证实两聚类间存在清晰的转录组分离，Kaplan-Meier生存分析显示两聚类患者总生存期显著不同，其中一聚类预后明显较差。
**机器学习鉴定LBP为LIHC的危险预后生物标志物。** 三重基因交集产生了42个重叠基因，单变量Cox回归分析鉴定出11个与总生存期显著相关的候选基因。CoxBoost和随机生存森林两种算法均一致鉴定脂多糖结合蛋白（LBP）为排名最高的特征基因。三个独立外部队列（GSE116174、GSE144269、GSE14520）的Kaplan-Meier分析一致表明LBP高表达患者总生存期显著差于低表达患者。
**功能注释揭示了LBP在LIHC中的生物学作用。** KEGG通路富集显示LBP相关DEGs显著富集于NF-kappa B信号通路、铁死亡、免疫反应和炎症信号通路。GO通路的GSEA进一步表明LBP密切参与炎症反应、免疫细胞活化和细胞因子介导的信号传导等生物学过程。
**LBP表达与LIHC免疫微环境特征相关。** TIMER算法分析显示高、低LBP表达组间多种免疫细胞丰度存在显著差异。LBP表达与ESTIMATE算法计算的基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分显著正相关。LBP表达与七类免疫调节因子（包括免疫刺激因子、抑制因子和趋化因子）的表达显著相关，表明LBP通过调节免疫调节因子参与LIHC TME中的免疫细胞串扰。
**LBP可作为LIHC免疫治疗反应的预测性生物标志物。** LBP表达与九种既有免疫治疗反应决定因子（CYT、IFNγIS、RohIS、DavoliIS、ImmuneScore、RIR、ICBnetIS、AyersExpIS和GEP）显著相关，高、低表达组间所有九种决定因子水平均存在显著差异。九个独立免疫治疗数据集的受试者工作特征（ROC）分析进一步确认了LBP对免疫治疗反应具有稳健可靠的预测性能。
**体外实验验证LBP的功能。** 在SNU-387和SNU-398两种LIHC细胞系中，siRNA介导的LBP敲低显著降低了内源性LBP mRNA表达。CCK-8实验显示LBP沉默在72小时培养期内显著减弱两种细胞的增殖速率，EdU掺入实验进一步证实LBP敲低显著抑制细胞增殖，表现为EdU阳性细胞数量显著减少。
## 讨论与结论
本研究的核心优势在于通过整合大规模单细胞和批量转录组数据，系统描绘了LIHC中UPR和IFNG相关的分子图谱，并鉴定LBP为连接UPR与IFNG的新型预后和免疫治疗反应预测标志物。LBP作为固有免疫的关键介质，通过结合脂多糖（LPS）激活TLR4/NF-κB信号通路调节炎症反应，本研究首次将LBP与LIHC中的UPR和IFNG联系起来。LBP表达与IFNG通路活性的稳健正相关暗示其可能通过调节IFNG信号转导及下游效应功能参与抗肿瘤免疫调控。
研究同时存在一定局限性：发现基于公共数据集的回顾性生物信息学分析，LBP的预后和预测价值需在大型前瞻性临床队列中进一步验证；仅进行了计算机模拟分析探索LBP与UPR、IFNG、免疫TME特征及免疫治疗反应的相关性，具体分子机制需通过体外和体内功能实验加以验证；LBP对免疫治疗反应的预测价值需在接受ICB治疗的真实LIHC患者队列中验证。
结论部分指出，该研究系统表征了LIHC中UPR和IFNG相关的分子景观，并鉴定LBP为新型UPR和IFNG相关预后生物标志物及免疫治疗反应预测因子。LBP与UPR、IFNG、免疫TME特征及免疫治疗反应密切相关，可作为临床可检测的候选生物标志物。这些发现为理解UPR和IFNG在LIHC中的作用提供了新视角，为LIHC患者的预后评估和精准免疫治疗奠定了基础。
