《Trees, Forests and People》：Physiological and transcriptomic responses of
Mallotus paniculatus to sustained drought stress: Implications for tropical coastal shelter forest restoration
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干旱制约着热带海岸林中幼苗的建立与生态恢复，而本地先锋树种对于多样化脆弱的防护林种植至关重要。白楸（Mallotus paniculatus）是一种环境适应性广泛的常见先锋树种，但其干旱响应机制仍不清楚。研究人员整合了生理测定、全长及短读长转录组学、加权基
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干旱制约着热带海岸林中幼苗的建立与生态恢复，而本地先锋树种对于多样化脆弱的防护林种植至关重要。白楸（Mallotus paniculatus）是一种环境适应性广泛的常见先锋树种，但其干旱响应机制仍不清楚。研究人员整合了生理测定、全长及短读长转录组学、加权基因共表达网络分析（WGCNA）及qRT-PCR，以表征白楸幼苗对持续干旱胁迫的响应。在持续断水后，气孔导度、碳同化、表观光呼吸及PSII光化学最大量子效率（Fv/Fm）下降，而水分利用效率升高。MDA和H?O?水平的升高表明氧化损伤，而POD和APX活性增强及渗透调节物质积累反映了抗氧化和渗透调节的响应。探索性WGCNA优先筛选出两个表达模式相反的候选模块。这些模块中的推定枢纽基因与细胞稳态、氧化还原及渗透代谢、调控、光合作用、中心代谢和光呼吸相关。对6个代表性候选基因的qRT-PCR分析支持其干旱响应的转录丰度模式。总体而言，持续干旱诱导的响应以水分保存和细胞保护为特征，同时伴随碳同化和表观光呼吸代谢的降低。这些发现为进一步评估白楸作为热带海岸防护林恢复的候选本地树种提供了初步的生理和转录组学证据。
论文解读
一、研究背景与科学问题
在全球气候变化背景下，干旱事件的频率和强度不断增加，对森林生态系统的结构和功能构成严重威胁。热带森林因其高水分需求和狭窄的水力安全边际而尤为脆弱。干旱会降低生产力、改变物种组成、侵蚀生物多样性并损害碳固存能力；长期水分限制抑制光合作用和碳固定，促进活性氧（ROS）积累和细胞损伤，最终可能导致水力失效、碳饥饿、生长衰退乃至树木死亡。由此产生的森林退化削弱了陆地碳汇和生态系统稳定性。因此，阐明树木干旱响应的生理和分子机制，对于鉴定抗性相关基因、开发耐旱种质资源以及增强森林恢复力至关重要。
热带海岸生态系统常面临多种环境约束，包括高盐度、贫瘠砂质土壤、强风和季节性干旱，这些因素严重限制幼苗建立和植被恢复。海岸砂质栖息地通常具有高渗透性和低持水能力的基质，使土壤水分亏缺成为限制幼苗建立和群落发育的主要胁迫因子。因此，鉴定具有强抗风性、耐盐性、干旱适应性和高环境恢复力的树种对于海岸防护林建设和生态恢复至关重要。海南岛位于中国南部热带季风区，降水主要集中在5月至10月，其余月份以季节性干旱为主，这种显著的水分季节性模式增加了海岸植被在旱季遭受水分亏缺的易感性。数十年来，中国南方海岸防护林主要由木麻黄（Casuarina equisetifolia）人工林主导，但长期单一栽培已导致林分结构简化、自然更新受限、病虫害增加和生态系统稳定性下降。在此背景下，探索具有旺盛自然更新能力和干旱适应性的本地树种，以促进从单一栽培人工林向近自然混交林转变，已成为恢复热带海岸生态系统和维护可持续海岸防护林的核心目标。
白楸（Mallotus paniculatus）是大戟科野桐属常见先锋树种，自然分布范围广泛，常见于次生林和受干扰生境，具有较强的环境适应性和自然更新潜力，在热带次生林演替和退化生态系统恢复中发挥重要生态作用。前期研究显示，大戟科物种可通过叶片结构调控协调水分利用效率和光合能力，白楸叶片提取物具有体外抗氧化活性，且在六种本地海岸树种干旱评估中表现出最高的光合性能。然而，其干旱响应的生理适应和分子调控机制仍不清楚，这限制了对其作为热带海岸恢复候选树种的循证评估。因此，研究人员提出假设：持续干旱会诱导与细胞维持和胁迫保护相关的基因表达，同时抑制与碳同化相关的基因表达。
二、研究内容与主要结论
为验证上述假设并表征白楸更广泛的干旱响应，研究人员对白楸幼苗进行渐进式断水干旱胁迫处理，整合生理测定、转录组测序和加权基因共表达网络分析（WGCNA），量化了与光合作用、表观光呼吸、叶绿素荧光、抗氧化防御和渗透调节相关的生理性状，利用探索性WGCNA优先筛选候选干旱响应模块和推定枢纽基因，并通过qRT-PCR验证六个代表性候选基因。研究旨在将生理变化与候选共表达网络联系起来，为评估白楸在热带海岸恢复中的应用提供证据。
研究得出以下主要结论：持续干旱诱导白楸产生以水分保存和细胞保护为特征的综合响应，同时伴随碳同化和表观光呼吸代谢的降低。具体而言，干旱显著降低气孔导度、净光合速率、表观光呼吸速率和PSII最大光化学效率，增加丙二醛（MDA）和过氧化氢（H?O?）含量，增强过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性，并促进脯氨酸和可溶性糖积累。转录组分析鉴定出大量差异表达基因，方向特异性KEGG富集分析显示叶片以下调光合碳同化相关通路为主。WGCNA优先筛选出蓝色和青绿色两个候选模块，其中青绿色模块枢纽基因主要涉及细胞稳态、氧化还原和渗透代谢及调控功能，干旱下多上调；蓝色模块枢纽基因主要涉及光合作用、代谢与转运等功能，干旱下多下调。qRT-PCR验证了六个代表性候选基因的干旱响应表达模式。
三、主要技术方法
研究人员采用的主要技术方法包括：生理测定方法，涵盖光合气体交换参数测定（使用LI-6800便携式光合系统）、表观光呼吸速率测定（通过常氧与低氧条件下净CO?同化差值计算）、叶绿素荧光参数测定（使用OS5p脉冲调制叶绿素荧光仪）、光合色素含量测定、氧化损伤指标与抗氧化酶活性测定以及渗透调节物质测定；叶片解剖和扫描电镜分析；全长转录组测序，采用PacBio Sequel II平台结合Illumina短读长RNA-seq进行转录本校正和表达定量；差异表达分析使用DESeq2，功能富集分析采用方向特异性KEGG通路富集；加权基因共表达网络分析（WGCNA）基于九个叶片RNA-seq样本构建共表达网络，识别候选模块和推定枢纽基因；qRT-PCR验证六个代表性候选基因的时间进程表达模式。样本来源为海南省海口市海岸次生林采集的白楸种子培育的幼苗。
四、研究结果
4.1 干旱胁迫诱导白楸表型、解剖和 stomatal 改变
持续干旱导致白楸幼苗出现明显叶片下垂、卷曲、黄化、萎蔫和可见脱水。与对照相比，干旱显著降低叶片厚度、上表皮角质层厚度和栅栏组织厚度，同时显著增加木质部和主脉厚度。扫描电镜显示对照气孔呈开放状态，而干旱胁迫气孔呈部分或几乎完全关闭状态，与气孔关闭和叶片解剖组织差异一致。
4.2 干旱胁迫重塑白楸幼苗整体生理状态
基于20项生理参数的分层聚类热图显示对照与干旱样本形成明显分离的聚类。主成分分析（PCA）显示PC1和PC2分别解释总方差的84.94%和7.65%，表明两组样本在整体生理特征上存在显著差异。
4.3 白楸关键生理性状对干旱胁迫的响应
干旱显著降低气孔导度（Gs）和净光合速率（Pn），表明水分亏缺诱导气孔关闭并限制叶片气体交换和碳同化。表观光呼吸速率（Pr）也显著下降，表明碳同化抑制伴随表观光呼吸活性降低。最大量子效率（Fv/Fm）显著降低，表明PSII光化学效率下降。MDA含量显著增加，表明膜脂过氧化和氧化损伤增强。APX活性显著增加，表明抗氧化响应部分增强，但MDA和H?O?的同步升高说明该响应未完全阻止干旱诱导的氧化损伤。脯氨酸和可溶性糖含量显著积累，表明渗透调节能力增强。
4.4 转录组测序与功能注释
通过PacBio全长转录组测序，经全长一致性处理、杂交纠错和去冗余后，共获得42,046条非冗余转录本，平均转录本长度2,715 bp，N50长度3,050 bp，表明转录组组装质量较高。转录本在NR、NT、Swiss-Prot、GO、KEGG、Pfam和KOG数据库中获得成功注释。
4.5 干旱胁迫下差异表达基因及方向特异性KEGG通路富集
以|log? fold change| > 1和FDR < 0.05为阈值，叶片中鉴定出2,711个差异表达基因（1,398个上调，1,313个下调），茎中4,894个（2,609个上调，2,285个下调），根中5,150个（2,435个上调，2,715个下调）。方向特异性KEGG富集分析显示，叶片上调基因显著富集于半乳糖代谢、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢及α-亚麻酸代谢通路；叶片下调基因显著富集于光合生物碳固定、碳代谢、光合作用、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢及乙醛酸和二羧酸代谢等十条通路，表明干旱下叶片光合碳同化及相关代谢过程受到显著抑制。茎和根则表现出涉及碳水化合物、氨基酸、脂质、能量、次生和胁迫相关代谢的更广泛调整。
4.6 探索性WGCNA优先筛选候选干旱响应模块和推定枢纽基因
WGCNA鉴定出12个颜色类别，包括11个共表达模块和灰色未分配基因集。模块特征基因与20项生理性状的相关性分析显示，蓝色模块与多项干旱响应生理性状（包括光合气体交换、叶绿素相关性状、氧化胁迫指标、抗氧化酶活性和渗透调节参数）相关性最强；青绿色模块与抗氧化防御、渗透调节、水分利用效率和光合相关参数等胁迫相关性状相关。因此，蓝色和青绿色模块被优先用于后续推定枢纽基因网络分析。青绿色模块推定枢纽基因分为细胞稳态相关、氧化还原和渗透代谢相关、调控相关及其他基因四类；蓝色模块推定枢纽基因分为代谢与转运相关、光合作用相关、调控相关、氧化还原酶相关及其他基因五类。
4.7 代表性干旱响应候选枢纽基因的时间进程表达模式
基于模块-性状关系和网络拓扑，从蓝色和青绿色模块中选出六个代表性候选枢纽基因进行qRT-PCR验证。青绿色模块的FMO1、TSN1和UBP7在干旱处理6、12和18天后均显著上调；蓝色模块的GLDP和RBCS在6天时强烈下调并维持低表达水平；BOU呈现阶段依赖性表达模式，6天下调、12天短暂上调、18天再次显著下调。在最终采样点（18天），FMO1、TSN1和UBP7上调，GLDP、RBCS和BOU下调，表达方向与RNA-seq结果一致。
五、讨论与结论
讨论部分指出，持续断水处理诱导白楸产生协调但生理代价高昂的响应，包括可见叶片萎蔫、解剖重塑、气孔关闭、碳同化降低、氧化压力和抗氧化及渗透响应增强。这一组合更适合解释为综合干旱响应表型，而非所有测定变化均为有益适应。叶片变薄和栅栏组织变薄与脱水相关的收缩和结构损伤一致，而非常见的旱生结构模式；主脉和木质部增厚可能反映长期水分亏缺下的维管重塑，但仅凭横截面厚度不能确定更高的水力导度或抗栓塞能力。气孔关闭限制水分损失但降低叶绿体CO?可用性，从而限制净光合作用。Fv/Fm显著降低表明光合抑制同时涉及气孔限制和光化学胁迫。MDA和H?O?增加证明水分亏缺伴随脂质过氧化和细胞氧化还原状态改变，POD和APX活性增强支持过氧化物清除能力增强，但MDA同步升高表明该响应未完全阻止氧化损伤。脯氨酸和可溶性糖积累支持渗透响应程序激活，但浓度变化本身不能证明这些化合物足以赋予耐旱性。整体而言，生理数据支持一种响应策略：气孔限制和碳同化降低与氧化还原缓冲和渗透调节物质积累同时发生，与持续干旱下资源从碳获取向细胞维持的重新分配一致。然而，叶片卷曲、黄化、解剖收缩和MDA升高表明这些保护性调整未能完全阻止明显的胁迫损伤。
转录组和叶片特异性WGCNA将干旱响应基因解析为12个颜色类别。蓝色和青绿色模块因其特征基因与光合、氧化、抗氧化、渗透和水分利用性状的强关联而被选择。网络和功能热图揭示两个候选模块之间的明显对比：青绿色模块包含归属于细胞稳态、氧化还原和渗透代谢及调控的高连接基因，多数干旱下表达升高；蓝色模块包含代谢与转运、氧化还原酶、光合作用和调控类别，多数高连接基因干旱下表达降低。这些相反的表达谱支持向胁迫响应调控和细胞维持的协调转变，同时削弱光合和中心代谢功能。组织水平KEGG谱表明干旱响应的空间分化转录特征。六个代表性基因因其在蓝色和青绿色模块中的高模块内连接性、干旱响应表达模式和功能注释而被优先作为候选枢纽基因。RBCS和GLDP的下调将WGCNA网络与碳固定和光呼吸代谢的通路水平抑制联系起来，与Pn和表观光呼吸活性降低一致。qRT-PCR结果确认了六个代表性枢纽基因在转录组采样阶段的转录丰度模式，支持了基于RNA-seq的表达分析一致性。
研究结论为：持续干旱诱导白楸产生以水分保存和细胞保护为特征、同时伴随碳同化和表观光呼吸代谢降低的响应。这些发现为进一步评估白楸作为热带海岸防护林恢复的候选本地树种提供了初步的生理和转录组学证据。
