《Frontiers in Oncology》：Selinexor enhances temozolomide efficacy in glioblastoma through modulation of multiple resistance-associated mechanisms
编辑推荐：
**摘要**
**引言：** 胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）仍是最具治疗抵抗性的癌症之一，而替莫唑胺（temozolomide, TMZ）耐药是阻碍持久临床应答的核心障碍。通过Selinexor抑制出核转运蛋白1（exportin-1,
**摘要**
**引言：** 胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）仍是最具治疗抵抗性的癌症之一，而替莫唑胺（temozolomide, TMZ）耐药是阻碍持久临床应答的核心障碍。通过Selinexor抑制出核转运蛋白1（exportin-1, XPO1）已成为克服实体瘤耐药的一种有前景的策略；然而，其能否使TMZ耐药的GBM细胞恢复药物敏感性及其潜在机制仍知之甚少。
**方法：** 研究人员在三种具有不同TMZ敏感性特征（LN18，耐药；U87MG，中度敏感；LN229，敏感）的GBM细胞系中，评估了Selinexor与TMZ单药及联合用药的效果，检测了细胞活力、凋亡、细胞周期分布、错配修复（mismatch repair, MMR）/生存相关基因表达、凋亡相关蛋白水平以及长期集落形成能力。
**结果：** Selinexor在三种细胞系中均能有效增强GBM细胞对TMZ的敏感性，其中在TMZ耐药背景下观察到的临床意义最为显著的效果。联合用药产生了协同性生长抑制和强烈的凋亡诱导，其效果远超任一单药单独作用，这一效应由MCL1和BIRC6的协同性抑制、错配修复基因表达的部分恢复以及CHK1介导的检查点激活共同驱动。联合治疗诱导了细胞核内p53积聚，显著降低BCL-2水平，增加PARP剪切，并持久抑制长期增殖能力。
**讨论：** 这些发现将Selinexor定位为耐药性GBM中具有机制合理性的TMZ增敏剂，并支持对该联合策略开展进一步的临床前及转化研究。
**图形摘要**
**论文解读：Selinexor联合替莫唑胺在胶质母细胞瘤中的增敏效应及机制研究**
**1. 研究背景与科学问题**
胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是2021年WHO中枢神经系统肿瘤分类中IDH野生型（WHO 4级）的最具侵袭性的胶质瘤亚型，其治疗手段包括手术、放疗和化疗。替莫唑胺（temozolomide, TMZ）是GBM化疗的一线烷化剂，通过在鸟嘌呤O6位点甲基化形成O6-甲基鸟嘌呤加合物，触发错配修复（mismatch repair, MMR）的无效循环，最终导致DNA双链断裂和细胞死亡。然而，TMZ耐药是导致治疗失败和肿瘤复发的核心障碍。MGMT启动子甲基化状态虽是重要预后标志物，但约50%的GBM患者即使存在MGMT启动子甲基化，仍会出现耐药，提示存在MGMT非依赖性的耐药机制。此外，MMR系统功能缺陷（如MSH2、MSH6等基因突变）和碱基切除修复（base excision repair, BER）通路过度激活均已被证实参与TMZ耐药。
核输出蛋白XPO1（CRM1）是真核细胞中负责转运肿瘤抑制蛋白（如p53、RB1、BRCA1/2）和促癌调节因子（如细胞周期蛋白、TERT）的关键转运体。XPO1在多种肿瘤中高表达并与耐药相关。Selinexor（KPT-330）作为首创的SINE类XPO1抑制剂，已获FDA批准用于多发性骨髓瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤，其在GBM中的研究显示可增强其他治疗手段的敏感性。然而，Selinexor能否使TMZ耐药的GBM细胞重新致敏，以及其在不同TMZ耐药背景下的具体分子机制尚不明确。本研究旨在系统阐明Selinexor联合TMZ在不同TMZ敏感性GBM细胞系中的作用及机制，为克服TMZ耐药提供理论依据。
**2. 研究内容与总体结论**
研究人员选用三种具有明确TMZ敏感性差异的GBM细胞系——LN18（TMZ耐药，MGMT启动子未甲基化）、U87MG（TMZ中度敏感，MGMT启动子甲基化）和LN229（TMZ敏感，MGMT启动子甲基化），系统评估了Selinexor与TMZ单药及联合用药的效应。研究发现，Selinexor在纳摩尔浓度下即可浓度依赖性地增强GBM细胞对TMZ的敏感性，且在TMZ耐药的LN18细胞中效果最为显著。联合用药产生协同性生长抑制和强效凋亡诱导，其机制涉及MCL1与BIRC6抗凋亡信号的协同抑制、MMR基因表达的部分恢复、CHK1介导的G2/M检查点激活、核内p53积聚以及BCL-2的下调。集落形成实验证实联合用药能持久抑制耐药细胞的长期增殖能力。该研究表明Selinexor是一种机制合理的TMZ增敏剂，其增敏作用不依赖于MGMT状态，为TMZ耐药GBM提供了新的治疗策略。
**3. 主要技术方法**
本研究主要使用了以下技术方法：采用MTT比色法检测细胞活力并计算半数抑制浓度（IC50）；利用SynergyFinder+软件的零相互作用效力（Zero Interaction Potency, ZIP）模型进行药物协同性分析；通过APC Annexin V/PI双染结合流式细胞术检测细胞凋亡；采用碘化丙啶（PI）染色结合流式细胞术分析细胞周期分布；利用实时定量PCR（qPCR）检测MMR通路（MSH2、MSH6、PMS2、MLH1）及生存/检查点相关基因（MCL1、BIRC6、CHK1）的表达；通过集落形成实验评估长期增殖能力；采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测PARP、Caspase-9、Bcl-2等凋亡相关蛋白水平；运用免疫细胞化学检测p53的核内定位。细胞系均购自ATCC，其中LN18（CRL-2610）、U87MG（HTB-14）、LN229（CRL-2611）。
**4. 研究结果**
**4.1 Selinexor增强GBM细胞对TMZ的敏感性**
通过MTT实验和ZIP协同性分析，研究人员发现Selinexor在三种GBM细胞系中均以纳摩尔级浓度产生剂量依赖性生长抑制，72小时抑制作用最强。TMZ的IC50值符合各细胞系的已知耐药谱：LN18最高（1729 μM），U87MG居中（698 μM），LN229最低（228.5 μM）。联合用药的剂量矩阵热图及固定TMZ浓度下递增Selinexor的实验表明，Selinexor能显著增强TMZ的体外生长抑制作用。ZIP协同性分析显示，在TMZ耐药的LN18细胞中，Selinexor（0.05–0.2 μM）与TMZ（50–200 μM）联合产生具有统计学意义的协同效应（平均ZIP评分为23.82，p=6.83×10?3），而高浓度TMZ区域显示拮抗或弱协同，表明耐药背景下存在真正的Selinexor介导的增敏效应而非简单相加。
**4.2 Selinexor与TMZ联合克服TMZ耐药GBM细胞的凋亡抵抗**
Annexin V/PI染色结合流式细胞术分析显示，在LN18细胞中，联合用药组的凋亡率显著高于任一单药组，平均差异达14.77%–41.43%。Delta凋亡分析证实两种药物对联合效应均有独立且成比例的正向贡献。值得注意的是，虽然ZIP模型在400 μM TMZ区域显示拮抗评分，但直接凋亡检测证实该剂量下联合组的绝对凋亡产量仍显著优于单药，提示数学协同模型存在已知局限，需结合功能性读数综合判断。U87MG细胞中也观察到联合用药显著增强凋亡，而TMZ敏感的LN229细胞中单药活性本底较高，联合用药的相对增益有限，体现了上限效应（ceiling effect）。
**4.3 Selinexor与TMZ联合在GBM细胞中诱导细胞系特异性细胞周期再分布**
PI染色细胞周期分析显示，三种细胞系呈现不同的细胞周期反应模式：LN18细胞中，联合用药组呈现剂量依赖性的S期向G2/M期再分布趋势，单药组无此现象，提示联合方案特异性激活G2/M检查点；U87MG细胞以S期积聚为主要联合特异性效应，与复制叉停滞一致；LN229细胞中所有含TMZ的组均显示G2/M期升高，反映了该敏感细胞系固有的DNA损伤检查点反应，联合用药未超越单药TMZ的效果。
**4.4 联合治疗调节参与治疗耐药的关键基因网络**
qPCR分析结果显示，在TMZ耐药的LN18细胞中，四种MMR基因（MSH2、MSH6、PMS2、MLH1）在联合组中的表达均高于任一单药组，提示联合用药部分恢复了MMR介导的损伤识别功能，而任一单药均无法独自实现。在LN229细胞中，所有含Selinexor的治疗组均显示MMR基因显著上调，反映了该细胞系完整的MMR通路持续激活状态。生存相关基因方面，LN18细胞中MCL1在24小时被联合组显著抑制（降至约0.10–0.35倍），而单药反而诱导其表达高于基线，提示单药触发的代偿性抗凋亡反应被联合用药特异性消除；BIRC6的表达模式与此类似。CHK1在联合组及含Selinexor的组别中表达升高，与G2/M检查点激活一致。LN229细胞中MCL1在各组普遍轻度抑制，BIRC6在TMZ单药组表达最高而联合组降低，CHK1在100 nM Selinexor联合组中表达最高。
**4.5 Selinexor与TMZ联合抑制TMZ耐药细胞的长期增殖能力**
LN18细胞集落形成实验显示，200 nM Selinexor联合400 μM TMZ可将集落面积降至约6%，而Selinexor单药为58%，TMZ单药为24%，即联合组较单药组分别降低约10倍和4倍。关键的是，任一单药均未能将集落形成抑制至未处理对照水平以下，而联合用药以剂量依赖性方式几乎完全消除了耐药细胞的集落形成能力，为耐药逆转提供了最直接的功能学证据。
**4.6 核内p53积聚驱动TMZ耐药细胞的凋亡蛋白信号**
免疫细胞化学显示，联合治疗组LN18细胞核内p53免疫反应性显著增强，与XPO1抑制导致p53核滞留的机制一致。Western blot分析显示，联合治疗使剪切型PARP升至2.42倍（TMZ单药为1.94倍），全长PARP降至0.64倍（TMZ单药为2.08倍），全长Caspase-9降至0.52倍（TMZ单药为2.01倍），而BCL-2降至0.05倍（TMZ单药为0.94倍）。值得注意的是，TMZ单药反而增加了全长PARP和Caspase-9的表达，提示这些蛋白的降低是联合方案特异性的效应，而非TMZ暴露的一般性后果。
**5. 讨论与结论**
本研究的核心发现是Selinexor在TMZ耐药（LN18）、中度敏感（U87MG）和敏感（LN229）三种GBM细胞系中均能增强TMZ的抗肿瘤效应，且这种增敏作用在耐药背景中最具临床意义。在机制层面，联合用药通过同时消除MCL1/BIRC6介导的抗凋亡缓冲、部分恢复MMR功能、激活CHK1介导的DNA损伤检查点并促进p53核积聚，瓦解了耐药细胞的多层防御体系。上述发现尤其值得关注的是LN18细胞虽然MGMT启动子未甲基化并表达功能性MGMT，却表现出最强的增敏效应，与Mapunda等人提出的"MGMT甲基化状态是Selinexor-TMZ联合敏感性的决定因素"的结论形成对比。研究人员据此提出存在一个独立于MGMT的第二耐药轴——即MMR功能缺陷联合抗凋亡信号激活，而Selinexor正是通过作用于这一通路来发挥增敏作用的。本研究结论如下：Selinexor通过协同抑制MCL1和BIRC6、部分恢复MMR基因表达、激活CHK1介导的检测点、促进核p53积聚以及下调BCL-2等多种机制，在TMZ耐药GBM细胞中恢复TMZ敏感性，可作为机制合理的TMZ增敏剂，支持进一步开展体内及临床转化研究。研究的局限性包括：仅使用体外细胞系模型、XPO1抑制仅通过核p53积聚间接推断、Western blot仅限于LN18细胞且为单一生物学重复、凋亡通路激活的证据依赖PARP剪切而非直接的caspase-3/9剪切片段检测，以及基因表达数据因实验间变异以趋势性变化进行解读。
