单细胞RNA测序揭示急性胰腺炎损伤与修复过程中腺泡细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的PANoptosis特征

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Single-cell RNA sequencing reveals PANoptosis signatures of acinar cells, macrophages, and neutrophils during injury and repair in acute pancreatitis

中文摘要翻译 背景： 急性胰腺炎（AP）涉及腺泡细胞损伤、炎症和组织重塑。尽管调节性细胞死亡途径参与AP进展，但PANoptosis的细胞类型特异性特征和动态变化仍不清楚。本研究旨在单细胞分辨率下表征胰腺细胞群体中与PANoptosis相关的特征。 方法： 研究人员建立了雨蛙素联合脂多糖诱导的小鼠AP模型。对野生型（WT）、AP和早期恢复组的胰腺组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。利用标志基因鉴定主要细胞类型和亚群。采用多种评分算法、伪时间分析和功能富集分析评估PANoptosis相关程序，并通过组织学和免疫组织化学分析进行验证。 结果： 单细胞图谱揭示了AP及恢复过程中胰腺细胞微环境的广泛重塑，表现为腺泡细胞减少、巨噬细胞和中性粒细胞浸润增加。腺泡细胞亚聚类鉴定出12个转录上不同的亚群，包括以Krt19、Epcam、Lcn2和Krt7为标志的具有导管样特征的损伤相关亚群。轨迹分析提示腺泡细胞从成熟消化酶产生的状态向应激相关和炎症状态动态转变。PANoptosis相关特征在炎症性腺泡细胞亚群中最为显著，尤其是簇10，其次是簇7、4和5。巨噬细胞和中性粒细胞分析进一步鉴定出PANoptosis高表达的炎症亚群，尤其是巨噬细胞簇4和中性粒细胞簇4。 结论： 本研究建立了AP损伤和恢复的单细胞图谱，揭示了腺泡细胞和炎症细胞群体中细胞特异性的PANoptosis程序，强调PANoptosis是连接腺泡细胞损伤、免疫激活和胰腺重塑的潜在桥梁。

论文解读

研究背景与问题

急性胰腺炎（AP）是临床最常见的消化系统急症之一，其临床病程可从轻度自限性炎症到伴有胰腺坏死、持续性器官衰竭甚至死亡的危重症。约20%的患者进展为重症，病死率约15%–35%，目前治疗仍以支持性治疗为主，缺乏特异性靶向治疗。现有证据表明，AP的早期病理事件主要源于腺泡细胞内的钙稳态紊乱、线粒体功能障碍、活性氧过度产生、消化酶原提前激活以及应激诱导的细胞死亡，这些事件随后通过释放损伤相关分子模式（DAMPs）和炎症介质放大局部及全身炎症反应。与此同时，免疫细胞并非被动应答者：中性粒细胞通过促进胰酶激活、形成中性粒细胞胞外陷阱加重组织损伤；巨噬细胞则在促炎状态与修复状态之间动态转化，参与坏死碎片清除和组织再生。

近年来，PANoptosis被提出作为一种整合焦亡、凋亡和坏死性凋亡关键特征的炎症性程序性细胞死亡模式，为理解复杂炎症条件下的细胞命运决定提供了新框架。在胰腺疾病中，腺泡细胞焦亡和坏死性凋亡均被证实参与AP发病，且ZBP1–PANoptosome介导的PANoptosis与AP炎症损伤密切相关。然而，PANoptosis在胰腺不同细胞类型中的特异性特征和动态变化尚不清楚，缺乏单细胞分辨率水平的系统表征。

研究内容与结论

本研究采用雨蛙素联合脂多糖（LPS）腹腔注射建立自限性小鼠AP模型，分别在造模前（WT）、造模后第1天（AP）和第4天（Recovery）收集胰腺组织，代表基线状态、损伤期和早期修复期。研究人员对三组胰腺组织进行单细胞RNA测序，构建了AP损伤与修复过程的单细胞图谱，并针对腺泡细胞、巨噬细胞和中性粒细胞进行亚群分析，重点解析PANoptosis相关信号的动态变化。

研究共获得77,445个细胞，经质控和去双细胞后保留58,804个高质量单细胞，注释为11种主要细胞类型。结果显示，AP组腺泡细胞比例显著下降，中性粒细胞和单核/巨噬细胞大量浸润；Recovery组细胞组成部分恢复，但免疫和基质细胞群仍存在持续改变，提示修复期炎症未完全消退。PANoptosis相关特征在特定细胞亚群中高度富集，而非均匀分布，支持PANoptosis的细胞类型和状态特异性调控。研究建立了一个从损伤到早期修复的PANoptosis信号轨迹图谱，为靶向PANoptosis高表达细胞亚群提供了新的治疗思路。

关键技术方法

本研究主要采用以下关键技术方法：

1. 1.
   单细胞RNA测序（scRNA-seq）：使用GEXSCOPE单细胞RNA文库构建试剂盒和MGI T7平台进行150 bp双端测序，获得基因-细胞表达矩阵。
2. 2.
   数据预处理与整合：使用Seurat包进行归一化、高变基因筛选、主成分分析，采用Harmony算法去除批次效应，通过t-SNE和UMAP进行可视化。
3. 3.
   细胞类型注释：基于经典谱系标志基因进行人工注释，鉴定出11种主要细胞类型。
4. 4.
   多算法基因集评分：采用AUCell、UCell、singscore、ssGSEA和AddModuleScore五种算法，对炎症反应、凋亡、坏死性凋亡、焦亡和PANoptosis基因集进行单细胞活性评分，并整合为综合评分。
5. 5.
   亚群分析：分别提取腺泡细胞、巨噬细胞和中性粒细胞进行二次聚类，结合差异表达分析、GO/KEGG/HALLMARK功能富集分析。
6. 6.
   轨迹推断：使用Monocle2进行伪时间分析，Slingshot进行谱系推断，CytoTRACE评估分化潜能。
7. 7.
   组织学验证：通过HE染色和免疫组化（IHC）验证巨噬细胞（F4/80）和中性粒细胞（Ly6g）的浸润情况。

样本来源：C57BL/6雄性小鼠（5–6周龄），购自北京华阜康生物科技股份有限公司，每组6只，每3只小鼠胰腺组织混合构建一个测序文库，每组2个样本。

研究结果

单细胞转录组分析揭示急性胰腺炎和恢复期的动态细胞重塑

HE染色显示WT组胰腺小叶结构完整，AP组出现明显组织损伤、腺泡破坏、间质水肿和炎症细胞浸润，Recovery组组织架构部分恢复。scRNA-seq分析鉴定出11种主要细胞类型，与WT相比，AP组中性粒细胞和单核/巨噬细胞比例显著增加，腺泡细胞比例相对减少。炎症反应评分显示AP组炎症信号增强，Recovery组较AP组降低但仍可检测到，提示修复期仍存在持续的炎症重塑。免疫组化验证了F4/80阳性巨噬细胞和Ly6g阳性中性粒细胞在AP组中的显著浸润。

腺泡细胞亚群分析揭示明显异质性及导管样转变

腺泡细胞二次聚类鉴定出12个转录上不同的亚群。WT样本主要富集于典型腺泡特征亚群，而AP和Recovery样本则包含多个疾病相关亚群。经典腺泡标志基因Cela2a、Cela3b、Cpa1和Ctrb1在多数亚群广泛表达，而导管相关基因Krt19、Epcam、Lcn2和Krt7在AP和Recovery富集的特定亚群中选择性升高，提示腺泡细胞获得了导管样转录特征，可能存在腺泡-导管化生样转变。

轨迹分析揭示腺泡细胞在损伤和修复中的动态状态转变

Monocle2伪时间分析重建了分支轨迹结构，成熟消化酶相关基因（Pla2g1b、Ctrl、Pnlip、Prss1、Prss3、Try10）和应激/炎症相关基因（Jun、Fos、Reg3g、Lcn2、Saa3、S100a8、S100a9、Cxcl2）沿轨迹呈现不同的动态表达模式。Slingshot和CytoTRACE分析进一步支持腺泡细胞从成熟消化酶分泌状态向应激相关和炎症状态的分支转变，提示AP诱导腺泡细胞显著的细胞可塑性。

功能富集分析揭示腺泡细胞亚群间代谢和炎症程序的差异

KEGG分析显示不同腺泡亚群富集于氨基酸代谢、脂质代谢、碳水化合物代谢、氧化磷酸化等代谢通路，以及JAK-STAT、Toll样受体、RIG-I样受体和NOD样受体信号等免疫相关通路。Hallmark分析进一步揭示了氧化磷酸化、糖酵解、脂肪酸代谢、炎症反应、IL6-JAK-STAT3信号、TNF-α/NF-κB信号、补体、干扰素反应、活性氧通路、凋亡和缺氧等亚群特异性激活。GO分析支持上述发现，涉及蛋白加工、内质网应激、酶原激活、消化、抗菌反应、炎症调节等生物学过程。

细胞死亡相关评分揭示腺泡细胞亚群中PANoptosis相关程序

对焦亡、凋亡和坏死性凋亡的分别评分显示，炎症性腺泡亚群（尤其是Cluster 10，其次Cluster 7、4、5）在多种算法下均表现出较高的细胞死亡活性，而成熟消化酶富集亚群（Cluster 1、2、6）活性较低。PANoptosis综合评分同样显示，损伤相关腺泡亚群PANoptosis活性较高，且AP和Recovery样本中的PANoptosis信号明显强于WT组。这些结果表明腺泡细胞死亡并非单一死亡模式主导，而是多种细胞死亡程序协同激活，支持PANoptosis参与腺泡细胞损伤和重塑。

巨噬细胞亚群分析鉴定出PANoptosis活化的炎症巨噬细胞亚群

巨噬细胞亚群鉴定出6个亚群。Cluster 0富集于AP样本，高表达Saa3、Lcn2、Cxcl3等炎症基因；Cluster 1主要见于Recovery组，以Apoe、Lyz2、Ctsd、Ms4a7为特征，呈吞噬/修复表型；Cluster 2富集抗原呈递相关基因（H2-Eb1、H2-Aa、H2-Ab1）；Cluster 3表达Ccl8、Cfh。PANoptosis评分显示，Cluster 4的PANoptosis活性最强，Cluster 0和1也相对较高，而Cluster 2和3较低。t-SNE可视化显示PANoptosis高表达的巨噬细胞主要分布于AP和Recovery样本中。

中性粒细胞亚群分析鉴定出PANoptosis活化的炎症性中性粒细胞亚群

中性粒细胞亚群鉴定出5个亚群，主要富集于AP组，WT组仅检测到少量。经典中性粒细胞标志物S100a8、S100a9、Cxcr2、Fcgr3、Itgam确认了亚群身份。Hallmark、KEGG和GO富集分析显示中性粒细胞亚群在炎症反应、IL6-JAK-STAT3信号、TNF-α/NF-κB信号、凋亡、低氧、活性氧通路、白细胞趋化、细胞因子信号等通路存在差异激活。PANoptosis评分显示Cluster 4的PANoptosis活性最高，Cluster 2中等，其余亚群较低，表明PANoptosis在中性粒细胞中优先富集于特定炎症亚群。

讨论与结论

讨论部分指出，腺泡细胞死亡是AP启动和进展的核心事件，但并非单一死亡模式主导，而是多种调控性细胞死亡途径共存并交叉对话。本研究通过单细胞转录组分析证明，腺泡细胞、巨噬细胞和中性粒细胞在损伤和早期修复阶段经历广泛的亚群重塑，并汇聚于以PANoptosis为中心的炎症性细胞死亡网络。研究还发现腺泡细胞存在从成熟消化酶分泌状态向应激相关和导管样表型转化的可塑性，且这种可塑性与炎症应激和细胞死亡程序激活密切相关。研究局限性包括：样本量有限且采用混合样本构建文库，可能降低个体间变异评估能力；仅覆盖三个时间点，未能完全捕获从初始损伤到完全恢复的连续动态过程；PANoptosis鉴定主要基于转录组特征评分和通路推断，而非PANoptosome组装、关键蛋白（caspases、RIPK/MLKL、GSDMD）激活或超微结构特征，反映的是“PANoptosis倾向”而非终末性PANoptotic细胞死亡的确定性执行；体内外功能验证仍需开展。

结论部分：本研究利用小鼠胰腺单细胞转录组分析，系统表征了AP早期损伤和修复阶段的细胞图谱，揭示了疾病进程中腺泡细胞命运重塑、炎症细胞重编程和PANoptosis相关分子特征的动态变化。这些结果不仅为理解AP中调控细胞死亡与免疫反应之间的复杂相互作用提供了新见解，也为未来开发更精准、分层化的治疗干预奠定了理论基础。