多骨性纤维发育不良颅颌面病变中淋巴与髓系异质性的单细胞图谱：基于组织学分型的免疫微环境解析

《Frontiers in Immunology》：Single-cell landscape of lymphoid and myeloid heterogeneity across type-stratified craniofacial lesions in polyostotic fibrous dysplasia

背景： 多骨性纤维发育不良（POFD）是一种由体细胞GNAS突变驱动的镶嵌性骨骼疾病，该突变组成性激活Gsα-cAMP信号通路，产生纤维-骨性颅颌面畸形。POFD病变在组织学上分为三种亚型——I型（结缔组织为主型）、II型（松质骨为主型）和III型（硬化骨为主型）——然而这些类别之间的免疫微环境仍未明确。本研究旨在解析不同POFD组织学类别之间淋巴系与髓系细胞的异质性及细胞间通讯网络。 方法： 研究人员对来自三例年龄和性别匹配的POFD患者（分别归类为I型（n=1）、II型（n=1）和III型（n=1））的上颌骨病变组织进行了单细胞RNA测序（scRNA-Seq）。经过严格质量控制后，共整合并聚类了24,567个细胞（中位每细胞1,762个基因）。使用CellChat推断配体-受体相互作用。 结果： 共解析出四个主要谱系：间充质、淋巴系、髓系和血管内皮系。淋巴系占比在不同亚型间存在差异（I型1.00%、II型5.10%、III型10.90%），而血管内皮系比例呈相反趋势（I型25.10%、II型9.90%、III型4.50%）。亚聚类鉴定出五个淋巴系亚群和六个髓系亚群。CD4+ T细胞在I型中最为丰富（51.10%），但在II型（36.50%）和III型（29.30%）中占比降低。CD8+ T细胞在I-III型中分别占2.10%、11.90%和11.20%；生发中心（GC）B细胞在I型中不可检出，在II型中占比微小（约1.60%），在III型中显著（约29.20%）。在髓系细胞中，M1巨噬细胞在I型中占9.90%，II型中占25.70%，III型中占15.30%；破骨细胞在I型中丰富（35.40%），但在II型和III型中稀缺（<5%）。树突状细胞（DCs）在I型中缺失，但在II型（1.90%）和III型（2.60%）中可检出。网络中心基因包括CD4+ T细胞和GC B细胞的LTB、TXNIP、FTH1和PABPC1，以及M1巨噬细胞和单核细胞的S100A8/9、CXCL8、CCL2/3/4和IL1B。细胞间通讯网络因亚型而异：I型和II型呈现相对简单的相互作用组，而III型表现出密集互联的信号网络，伴有增强的M2巨噬细胞-单核细胞、M2巨噬细胞-GC B细胞（CXCL12-CXCR4、APP-CD74）以及GC B细胞-单核细胞轴，同时CD4+ T细胞-GC B细胞（CLEC2D-KLRB1、ADGRE5-CD55）和M1巨噬细胞-CD4+ T细胞串扰减弱。通路富集分析揭示了淋巴系和髓系区室中氧化磷酸化、NF-κB和抗原呈递级联的亚型特异性激活。 结论： 本研究提供了首个POFD单细胞免疫图谱，描绘了三种组织学亚型间淋巴系和髓系异质性。所鉴定的亚型特异性标志物和细胞间通讯架构为诊断分层提供了候选生物标志物，并揭示了这一致畸性骨疾病的潜在免疫调节靶点。

论文解读

一、研究背景与科学问题

多骨性纤维发育不良（POFD）是McCune-Albright综合征（MAS）的主要骨骼表现，由体细胞GNAS突变驱动，该突变组成性激活Gsα-cAMP信号通路，促进成骨细胞分化并产生扩张性纤维-骨性病变、颅面骨质增生和骨骼不对称。既往研究已证实免疫细胞在骨骼生理性重塑中发挥关键作用：B细胞通过RANKL表达调节破骨细胞生成，静息T细胞保护骨骼而活化T细胞促进NF-κB和TNF-α产生从而驱动破骨细胞形成和骨丢失，单核细胞通过BMP-2和细胞因子信号支持成骨分化。然而，POFD病变按组织学可分为三种亚型——I型（结缔组织为主型）、II型（松质骨为主型）和III型（硬化骨为主型）——各亚型间淋巴系和髓系细胞亚群的组成差异、区分这些类别的转录组特征以及细胞间网络如何重塑病变微环境，此前均未明确。既往针对纤维发育不良的单细胞研究主要聚焦于骨祖细胞群体，造血成分常被排除在外。因此，本研究旨在通过单细胞RNA测序（scRNA-Seq）系统比较三种POFD组织学亚型间淋巴系和髓系的组成、功能及细胞间通讯，填补这一知识空白，为免疫信息指导的诊断和治疗策略奠定基础。

二、研究设计与技术方法

研究人员从上海交通大学医学院附属第九人民医院招募了三例年龄和性别匹配的男性POFD患者（各亚型n=1），均经CT三维重建影像评估、临床CFDSS评分和双盲病理组织学评估确诊分型。术中从上颌骨相同解剖部位切除病变组织，经II型胶原酶消化制备单细胞悬液，使用DECODER 3'单细胞试剂盒构建文库并在Illumina NovaSeq 6000平台测序。数据分析采用Seurat进行质控和聚类，Harmony和fastMNN双重批次效应校正（kBET拒绝率<5%、轮廓宽度<0.02、ARI≥0.90），LIGER对淋巴系和髓系亚群再聚类，Scrublet检测双细胞，AUCell和SingleR验证注释。差异表达基因通过DAVID进行GO和KEGG富集分析，STRING构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并由cytoHubba鉴定枢纽基因，CellChat推断配体-受体细胞间通讯，免疫组化（IHC）独立验证IL1B蛋白表达趋势。

三、研究结果

3.1 单细胞RNA测序揭示POFD组织学亚型间的不同细胞类型

研究人员对三例POFD患者的上颌骨病变组织进行scRNA-Seq，经整合和严格质控后获得24,567个细胞（平均每细胞1,762个基因）。细胞分为四个主要谱系：间充质、淋巴系、血管内皮系和髓系，解析为18个转录组学不同的聚类。比例分析显示间充质为优势群体（I型69.30%、II型84.00%、III型75.40%），其次为血管内皮系（I型25.10%、II型9.90%、III型4.50%）、淋巴系（I型1.00%、II型5.10%、III型10.90%）和髓系（I型4.70%、II型1.10%、III型9.20%）。这些亚型相关的组成差异提示淋巴系和血管内皮系区室随病变组织学而变化。

3.2 淋巴系和髓系细胞DEGs的功能分析与枢纽基因鉴定

研究人员对淋巴系和髓系差异表达基因（DEGs）进行PPI分析。II型淋巴系相对于I型的top-50枢纽基因包括HSPA1B、HNRNPA1、EEF2、RACK1、CALM2和ACTG1；III型相对于II型呈现不同枢纽基因集，包括HSPA6、HSPE1、HSPA1B、HNRNPA1、EIF4A1和PABPC1。II型髓系相对于I型的枢纽基因包括CXCR2、CCL3L1、FCGR3B、MMP9、ANXA2和CTSK；III型髓系相对于II型呈现独特特征，包括CCL2、CCL3、CCL4、CXCL2、CXCL3、CXCL8和CCR7。

3.3 淋巴系和髓系亚群的鉴定及其标志基因

研究人员分离1,649个淋巴系细胞进行亚聚类，鉴定出五个淋巴系亚型：CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、初始T细胞、生发中心（GC）B细胞和调节性T细胞（Tregs）。组成分析显示CD4⁺ T细胞和初始T细胞在I型（95.80%）和II型（86.10%）中占主导；CD4⁺ T细胞丰度从I型（51.10%）降至II型（36.50%）和III型（29.30%）；CD8⁺ T细胞在I-III型中分别占2.10%、11.90%和11.20%；GC B细胞在I型中缺失、II型中微小（约1.60%）、III型中显著（约29.20%）。研究人员还在1,251个细胞中鉴定出六个髓系亚群：M1和M2巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞、破骨细胞和树突状细胞（DCs）。II型中M1巨噬细胞和单核细胞占髓系区室的92.40%；M1巨噬细胞在II型（25.70%）和III型（15.30%）中较I型（9.90%）升高；破骨细胞在I型中占髓系细胞的35.40%，但在II型（1.00%）和III型（4.40%）中稀缺；DCs在I型中缺失、II型中占1.90%、III型中占2.60%。各亚群标志基因方面，Tregs表达EIF2AK2、ISG20、IFIH1、OAS1和XAF1；CD8⁺ T细胞表达GZMH、CLIC3、XCL2、NKG7和KLRF1；GC B细胞表达FTH1、PABPC1、GPR183、ATP1B3和GLIPR1；初始T细胞表达HSP90AA1、UBE2S、DNAJA1、MT1X和DNAJB1；CD4⁺ T细胞表达LTB、TXNIP、XIST、RBL2和TRAF3IP3。DCs表达GZMB、IGHM、JCHAIN、MS4A1和CD79A；破骨细胞表达SPP1、MMP9、CTSK、ACP5和CKB；肥大细胞表达HPGD、CTSG、CPA3、TPSAB1和TPSB2；M1巨噬细胞表达IFITM2、CSF3R、AQP9、S100A9和S100A8；M2巨噬细胞表达CCL8、SELENOP、RNASE1、C1QA和FOLR2；单核细胞表达EREG、HLA-DPB1、HLA-DQB1和LYZ。淋巴系中CST7和TRBC2表达从I型到III型递增，髓系中IL1B和CXCL8表达在II型和III型中相对I型升高（P<0.05）。IHC验证显示IL1B表达趋势与scRNA-Seq数据一致。GC B细胞在淋巴系亚群中唯一表达IL4R，破骨细胞在髓系亚群中唯一表达ACP5。

3.4 不同T细胞亚群DEGs的通路富集分析

II型相对于I型，CD4⁺ T细胞DEGs富集于胞质翻译、核糖体小亚基生物发生与组装、ncRNA/rRNA加工与代谢及SSU-rRNA成熟；KEGG通路包括白细胞跨内皮迁移、吞噬体、核糖体和中性粒细胞胞外陷阱形成。III型相对于II型，CD4⁺ T细胞DEGs富集于凋亡信号调控、病毒生命周期、胞质翻译、有氧呼吸、氧化磷酸化和线粒体ATP合成；KEGG通路包括NF-κB信号、氧化磷酸化、凋亡和神经退行性疾病。CD8⁺ T细胞在III型相对于II型的DEGs富集于免疫应答、胞质翻译、细胞杀伤、核糖体生物发生、白细胞介导的细胞毒性和ATP合成；KEGG通路包括氧化磷酸化、凋亡、脂质代谢、NK细胞细胞毒性和ROS相关化学致癌。初始T细胞的富集特征与CD4⁺ T细胞高度一致，提示两者转录组变化在POFD亚型间具有协同性。

3.5 不同髓系亚群DEGs的通路富集分析

II型相对于I型，M1巨噬细胞DEGs富集于能量获取、有氧呼吸、氧化磷酸化和ATP合成，涉及线粒体内膜、呼吸体、氧化还原酶复合物等细胞组分；KEGG通路包括蛋白酶体、TCA循环、吞噬体、溶酶体和氧化磷酸化。单核细胞在II型相对于I型的DEGs富集于胞质翻译、核糖体生物发生和氧化磷酸化；KEGG通路包括蛋白酶体、抗原加工、线粒体自噬和氧化磷酸化。III型相对于II型，单核细胞DEGs富集于凋亡信号调控、淋巴细胞活化、抗原加工和MHC II类肽呈递；KEGG通路包括脂质代谢和核糖体。破骨细胞在III型相对于I型的DEGs富集于细胞-细胞黏附调控、白细胞活化、抗原加工和MHC II类呈递；KEGG通路包括Th17分化、抗原加工、Toll样受体信号、吞噬体、Th1/Th2分化和IL-17信号。

3.6 POFD组织学亚型间的细胞间通讯网络

研究人员使用CellChat绘制淋巴系和髓系亚群间的配体-受体相互作用图谱。I型和II型病变中，M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、单核细胞、CD4⁺ T细胞和初始T细胞间存在广泛串扰。II型中M1-M2巨噬细胞、M1巨噬细胞-单核细胞和M2巨噬细胞-单核细胞相互作用较I型增强，而M1巨噬细胞-CD4⁺ T细胞、M1巨噬细胞-初始T细胞和初始-CD4⁺ T细胞通讯减弱。III型中相互作用组更复杂，纳入CD8⁺ T细胞、GC B细胞和Tregs；M2巨噬细胞-单核细胞、M2巨噬细胞-GC B细胞和GC B细胞-单核细胞相互作用较II型增强，而M1巨噬细胞-CD4⁺ T细胞、GC B-CD4⁺ T细胞和Treg-CD4⁺ T细胞串扰减弱。具体配体-受体对方面，I型中ITGB2-ICAM1和PTPRC-MRC1介导M2巨噬细胞-单核细胞通讯，TNF-TNFRSF1B和PTPRC-MRC1参与初始T细胞-单核细胞串扰；II型中CD74-CXCR4和CD74-CD44分别塑造初始T细胞-单核细胞和CD4⁺ T细胞-单核细胞通讯；III型中CD99-PILRA、CD6-ALCAM和ADGRE5-CD55调节CD4⁺ T细胞-单核细胞通讯，CLEC2B/C/D-KLRB1介导CD4⁺ T细胞-GC B细胞和初始T细胞-GC B细胞串扰，SPP1-CD44、COL1A1-CD44和COL1A2-CD44支撑M1巨噬细胞-单核细胞、M1巨噬细胞-GC B细胞和M1巨噬细胞-Treg通讯，而TNF-TNFRSF1B、SPP1-CD44/CD45、LGALS9-CD45、CXCL12-CXCR4和APP-CD74塑造M2巨噬细胞-单核细胞、M2巨噬细胞-GC B细胞和M2巨噬细胞-Treg信号。

四、讨论与结论

讨论部分指出，既往纤维发育不良的单细胞研究主要集中于骨祖细胞群体，造血成分常被排除；本研究首次发现适应性免疫成分在III型病变中占细胞总量的10.9%，这一发现具有新颖性。既往报道将CXCL8异常表达归因于病变骨实质，而本研究数据将其产生定位于M1巨噬细胞和单核细胞，凸显了解析细胞来源对细胞因子功能归属的必要性。研究人员推测I型中高丰度的LTB阳性CD4⁺ T细胞可能通过LTβR介导的旁分泌信号维持间充质区室通讯，II型和III型中细胞毒性CD8⁺ T细胞的积累提示采用溶细胞表型。GC B细胞在III型中显著（约29.2%），其标志基因FTH1和PABPC1分别编码铁储存蛋白和mRNA稳定因子，研究人员推测GC B细胞介导的铁螯合可能限制破骨活性。破骨细胞在I型中占髓系细胞35.4%但在II型和III型中稀缺，此差异可能反映各组织学类别的内在生物学：I型富含纤维结缔组织，可能需要活跃骨吸收进行重塑。M1巨噬细胞在II型和III型中富集，其转录组富集氧化磷酸化基因，重现促炎巨噬细胞的生物能量表型。II型和III型中出现的携带B淋巴系特征（CD79A、JCHAIN、MS4A1）的DCs提示浆细胞样表型，可能试图向CD4⁺ T淋巴细胞呈递突变Gsα衍生新抗原。尽管使用八种HPC标志物，未鉴定出独立HPC群体，这与FD中造血骨髓被纤维-骨性组织替代、成人颅面骨基线造血活性极低以及GNAS突变诱导的BMSC源性造血微环境破坏一致。

研究局限性包括：每亚型仅一例样本，观察到的差异可能反映个体变异而非真实亚型特异性生物学，结果应视为初步发现；胶原酶组织解离可能诱发应激性转录程序；图谱仅限于颅颌面骨骼，其他解剖部位可能呈现不同免疫架构；3'端单细胞测序无法检测GNAS编码变异，未能确定携带激活GNAS突变的具体细胞谱系；候选生物标志物和治疗靶点需在更大独立队列和功能研究中验证；所有机制解释均来自计算分析和文献关联，而非实验干预。

结论部分指出，通过跨三种POFD组织学亚型部署单细胞转录组学，研究人员揭示了结缔组织为主型、松质骨为主型和硬化骨为主型病变间免疫组成存在显著差异。所鉴定的亚型特异性标志物（LTB、TXNIP、FTH1、PABPC1、CXCL8和IL1B）和通讯架构为诊断分层提供了候选生物标志物，并提名了假定的治疗靶点。这些数据强调POFD病变具有免疫异质性，为未来基于机制的研究奠定了基础。