基于基质调理与磁珠目标转移的荧光适配体-CRISPR/Cas12a 法检测河水中卡那霉素

《Talanta》：Matrix conditioning and magnetic bead target transfer for fluorescence aptamer-CRISPR/Cas12a detection of kanamycin in river water

摘要• 适配体-Cas12a检测方法采用基质调控与磁珠目标物转移技术。• 基质调控降低了腐殖酸和无机离子的干扰。• 磁珠富集并转移卡那霉素进入检测系统。• 该工作流程可在真实河水样品中实现卡那霉素分析。引言卡那霉素（KAN）是一种代表性的氨基糖苷类抗生素，广泛用于兽药、水产养殖和农业生产[1]。残留的卡那霉素可通过废水排放、农业径流和水产养殖排放进入地表水[2]。一旦进入水环境，卡那霉素可能持续存在并造成生态风险，同时促进抗生素抗性传播[3]。因此，对环境水体中卡那霉素的敏感监测对于基于风险的筛查具有重要意义。已有研究提出卡那霉素抗性选择预测无影响浓度（PNEC）为2 μg/L[4]。传统仪器方法，如液相色谱-质谱联用技术，可提供准确的定量结果[5]。然而，这些方法通常依赖大型专用设备、繁琐的样品前处理、经过培训的操作人员以及集中化的实验室设施。这些要求限制了其在专业实验室之外的环境筛查中的可及性。与此同时，已开发出多种用于化学和生物分析的信号传感器平台，包括纳米酶传感[6]、场效应晶体管传感[7]和表面增强拉曼光谱（SERS）生物传感[8]。尽管取得这些进展，环境水体中卡那霉素检测仍需一种灵敏且易得的生物传感工作流程。适配体是光学生物传感中极具吸引力的识别元件，因为可化学合成、易于修饰[9]，并可用于构建结构切换探针[10]。对于卡那霉素等小分子，这种结构切换行为可用于在目标结合时释放一条核酸链[11]。然而，仅依靠目标诱导的链释放所提供的信号输出有限，可能无法满足痕量环境分析的灵敏度要求[12]。因此，需要额外的扩增模块来实现痕量卡那霉素的灵敏检测。成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas12a为使用适配体检测小分子提供了高效的扩增模块[13]。一旦由释放的核酸链激活，Cas12a通过其反式切割活性切割单链DNA（ssDNA）报告基因[14]。该策略已用于几种采用结构切换适配体的适配体-CRISPR/Cas12a检测方法[15,16]。在卡那霉素检测方面，一种金属标记的CRISPR/Cas12a生物检测方法实现了超灵敏检测[17]。该方法将适配体调控的激活剂释放与元素标记报告基因及电感耦合等离子体质谱（ICPMS）检测相结合，需要专门用于元素分析的仪器。几种荧光或便携适配体-CRISPR检测方法通过多步分子扩增提高了检测灵敏度[18,19]。这些研究展示了适配体-CRISPR策略用于灵敏检测的潜力。尽管取得这些进展，CRISPR/Cas12a扩增前的基质效应仍未得到直接解决。此外，一些检测方法在分析前采用了样品稀释[20]。虽然稀释可能降低基质干扰，但也会降低输送至检测系统的目标物浓度。因此，需要能够在不减少目标物输入的情况下降低基质干扰的策略。仅依靠强力的下游扩增无法克服环境水分析中的基质干扰[21]。河水含有无机离子、腐殖质、悬浮颗粒及其他共存成分[22]。天然有机物可能与抗生素相互作用，改变其在水环境中的可用性[23,24]。二价金属离子可能改变腐殖质的聚集行为[25]，并影响适配体-目标物相互作用及后续链置换[26]。Cas12a只有在成功识别目标物后才能扩增核酸信号。它无法补偿因基质结合、共沉淀或低效上游转移导致的信号损失。因此，必须降低基质干扰，以提高卡那霉素向适配体-CRISPR/Cas12a检测系统转移的效率。在本工作中，我们开发了一种用于复杂水基质中卡那霉素检测的荧光适配体-CRISPR/Cas12a工作流程，整合了基质调控与磁珠目标物转移技术（图1）。引入基质调控以降低腐殖酸（HA）和无机离子的干扰；羧基功能化磁珠（Carboxyl-MBs）则从更大体积的样品中捕获卡那霉素并将其转移至适配体检测系统。随后通过适配体链置换和Cas12a荧光读数检测转移后的卡那霉素。使用包含腐殖酸和无机离子的定义模型基质评估该工作流程。通过比较有无基质调控时的卡那霉素响应来评估基质调控的效果。随后在调控后的模型基质中测试不同卡那霉素浓度下的响应。使用加标真实河水样品进行回收率测试。本工作旨在提高荧光适配体-CRISPR/Cas12a检测的基质兼容性，用于河水中痕量卡那霉素分析。分节摘要2.1 材料与试剂卡那霉素标准粉和Tris-HCl缓冲液购自上海生工生物工程技术服务有限公司。盐酸、氯化钠、硫酸钙、硫酸镁、碳酸氢钠、氯化钾和氯化镁试剂购自国药集团化学试剂有限公司。红霉素（ERY）、氯霉素（CAP）、链霉素（STM）、腐殖酸（HA）及乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。Cas12a蛋白及NEBuffer 2.1购自新英格兰生物实验室（New England Biolabs）。3.1 适配体-CRISPR/Cas12a检测方法的构建与优化已有研究报道了一种用于卡那霉素检测的荧光DNA链置换生物传感器，其检出限（LOD）为0.1 μM[27]。在该系统中，一条FAM标记的适配体与一条淬灭剂标记的互补链杂交。当卡那霉素结合后，适配体与淬灭剂标记链解离，导致FAM荧光增强。为提高河水中卡那霉素检测的灵敏度，将CRISPR/Cas12a整合至链置换系统中以实现信号扩增。在该设计中，4 结论综上所述，我们开发了一种整合基质调控与磁珠目标物转移的适配体-CRISPR/Cas12a工作流程，用于复杂水基质中卡那霉素的检测。基质调控降低了腐殖酸和无机离子的干扰。磁珠目标物转移捕获卡那霉素，并将其以小体积洗脱液的形式转移。这两个步骤提高了卡那霉素进入下游适配体-CRISPR/Cas12a检测系统的效率，从而实现了在模型基质中更低浓度下的卡那霉素检测，CRediT作者贡献声明Tianyi Yang：起草初稿、方法论、概念构思。Xiaoping Yu：形式化分析、数据整理。Jian Wu：审阅与编辑、监督、项目管理、经费获取、概念构思。创新性声明本工作通过解决CRISPR扩增前在复杂河水中发生的信号损失问题，改进了卡那霉素的荧光适配体-CRISPR/Cas12a检测方法。基质调控与磁珠目标物转移降低了基质干扰，在调控后的模型基质中实现了明确的浓度响应，并支持加标真实河水样品中的准确回收率分析。利益冲突声明作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。致谢本研究由中国浙江省"三农九方"计划（项目编号：2025SNJF021）资助。作者：Tianyi Yang｜Xiaoping Yu｜Jian Wu