三维纳米打印结构促进脑类器官与拓扑引导神经网络稳健整合

《Small》：3D Nanoprinted Structures Promote Robust Integration of Brain Organoids into Topography-Guided Neuronal Networks

基于双光子聚合的三维纳米打印（3DN）是制造高度特化培养平台、实现引导性神经元网络的有力工具。然而，尽管3DN提供了设计自由度，能够主动引导脑类器官在定位、基底整合及神经突向外生长方面行为的特化培养平台仍较为缺乏。本研究通过三维纳米打印斜坡（slope）、漏斗（funnel）、杆（rod）、台阶（step）和壁（wall）结构，实现了类器官的精确可靠定位，促进了紧密的类器官-基底界面，并决定了神经突的生长方向。承载这些结构的培养平台被制备于盖玻片上，以便在标准12孔培养板中进行培养。培养于其上的人类皮层类器官（hCOs）表现出动作电位的发放，凸显了3DN结构的生物相容性。斜坡和漏斗引导hCOs沉降，杆被hCOs包裹，壁和台阶则引导神经突生长及细胞沿其边缘迁移。最终，一个包含所有结构的培养平台展示了两个脑类器官受控共培养的潜力。所建立的3DN结构为脑类器官在引导性神经元网络中的整合铺平了道路，从而可能提升脑类器官在特化和定制化脑模型中的应用性。

论文解读：三维纳米打印结构促进脑类器官与拓扑引导神经网络稳健整合

一、研究背景与问题

脑类器官（brain organoids）是由多能干细胞或供体组织衍生的、自组织的三维多细胞模型，能够重现脑区的某些细胞构筑和功能特征，被广泛用于中枢神经系统（CNS）发育与疾病的深入研究。然而，天然脑类器官及 assembloids（多种区域化类器官的组合体）仍缺乏人脑的关键结构特征，如血管化和白质特征性的大轴突束。类器官芯片（Brain Organoid-on-a-Chip, BOoC）作为脑芯片（Brain-on-a-Chip）的特化类型，旨在通过将类器官与合成细胞外环境结合，重建脑的微环境。传统BOoC培养平台的制造主要依赖软光刻和光刻技术，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制模塑或SU-8图案化，这些方法虽广泛使用，但在设计复杂性上存在固有局限。此外，类器官的定位常依赖针头、镊子或宽泛的限位结构，阻碍了BOoC装置的简单、准确和可靠组装。尽管三维打印（3D printing）特别是双光子聚合基三维纳米打印（3DN）已被引入以简化制造流程并增加设计自由度，但能够主动促进脑类器官整合入引导性神经元网络的培养平台仍然缺乏，具体表现为缺乏能同时实现类器官精确定位、紧密类器官-基底界面以及神经突引导的结构。因此，本研究旨在填补这一空白。

二、研究内容与结论

研究人员建立了包含杆（rod）、漏斗（funnel）、斜坡（slope）、台阶（step）和壁（wall）等不同表面拓扑结构的3DN培养平台。这些平台制备于盖玻片或硅基底上，可置于标准12孔培养板中培养人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的人类皮层类器官（hCOs）。经过14天培养，通过免疫细胞化学（ICC）和膜片钳电生理分析验证了生物相容性，hCOs上的神经元能够发放动作电位（APs）。漏斗、斜坡和杆结构介导了类器官-结构相互作用，即促进了播种时的精确可重复定位，并通过包裹或缠绕杆结构促进了紧密界面。壁和台阶结构则通过引导细胞迁移和神经突沿边缘生长，介导了精细的神经突-结构相互作用。研究人员还将这些结构高效扩展为大型培养平台，实现了两个hCOs的引导性共培养，证明了3DN卓越的设计灵活性。此外，内化的杆结构为未来整合严格电学接口提供了潜在平台。该研究发表于《Small》期刊，为脑类器官在拓扑引导神经网络中的整合铺平了道路，可能推动下一代BOoC装置的发展。

三、关键技术方法

该研究主要采用了以下关键方法：基于双光子聚合的3DN技术（使用Nanoscribe Photonic Professional GT2和IP-Q树脂）制造微米至毫米级的三维培养结构；采用PDMS粘附层解决结构在显影过程中的收缩剥离问题；利用临界点干燥（CPD）结合扫描电子显微镜（SEM）对毫米级结构上的微米级神经突进行成像分析；通过免疫细胞化学（ICC）和膜片钳电生理记录评估生物相容性；使用光学相干断层扫描（OCT）观察水合状态下的类器官-结构相互作用。样本来源于WiCell的野生型hiPSC系（WISCi004-B）。

四、研究结果

2.1 采用的三维纳米打印结构：研究人员将3DN结构分为精细、引导、先进和复杂结构，涵盖微米至毫米尺度。精细结构包括斜坡/漏斗、杆、壁/台阶，引导结构如Flat（阴性对照）、Key（阳性对照）、Rods、Steps和Slats等。先进结构为引导结构的改良版，复杂结构则用于类器官共培养。所有结构底部均添加了锥体平台并加载PDMS以增强粘附。

2.2 实验流程的实现：通过在约12 mm × 12 mm的硅基底或盖玻片上进行3DN，实现了在标准12孔培养板中的培养。由于IP-Q树脂的固有自发荧光和样品高度，光镜成像受限，最终采用CPD结合SEM进行神经突追踪。PDMS粘附层确保了结构在培养和分析过程中的附着，该平台在PBS中可稳定储存超过12个月。

2.3 生物相容性：通过ICC和膜片钳分析，hCOs在IP-Q结构上表现出细胞迁移和神经突网络形成。TUBB3阳性细胞约69%，MAP2阳性细胞约72%，与玻璃对照组无显著差异。电生理分析显示，IP-Q和玻璃上神经元的AP高度（约48 mV）、时程（约5 ms）、后超极化（约22 mV）、阈值（约?24 mV）以及静息膜电位（约?57 mV）等参数均无统计学显著差异，证明IP-Q具有良好的生物相容性。

2.4 类器官-结构相互作用：Key结构的环形壁限定了hCOs的沉降位置，先进版本通过引入漏斗形状和斜坡，提高了播种效率并引导类器官向隧道入口定位。Rods结构通过hCOs对杆的包裹或缠绕，显著增强了类器官粘附强度，OCT和SEM证实了这种紧密界面。

2.5 神经突-结构相互作用：Steps结构显著促进了?45°方向的神经突取向（约27%），Slats⊥显著促进了±90°方向（约22%），Slats∥促进了0°方向（约31%）。先进Key结构中的台阶结构同样引导神经突沿±90°方向生长，且随距离增加引导效果增强。Slats⊥显著限制了细胞和神经突的迁移距离，验证了壁结构的引导效应。

2.6 类器官共培养概念验证：在镜像的先进Key结构上培养两个hCOs，类器官中位偏移仅167 μm，表明定位成功。MAP2阳性神经元迁移距离达1.3 mm，跨越了整个观察窗口，TUBB3阳性神经突上检测到表达突触素1（SYP1）的突触前末梢，表明网络形成和潜在的突触连接。

五、讨论与结论

讨论部分指出，传统BOoC制造受限于软光刻的设计复杂性，而3DN提供了快速、灵活的设计制造途径。本研究所建立的精细结构分别解决了类器官精确定位（斜坡/漏斗）、紧密界面（杆）和神经突引导（壁/台阶）三大关键问题。杆结构还可能作为未来内部电极的平台，用于追踪类器官内部的神经元通信。神经突引导效应与已有2D和2.5D培养研究一致，但本研究首次在3D类器官体系中系统验证了接触引导现象。研究结论表明，所建立的3DN培养平台显著促进和改善了BOoC制造的每一步：斜坡和漏斗促进精确定位并保护沉降中的类器官；杆增强粘附强度；台阶和壁限制神经突沿结构生长。该平台还可应用于其他区域特异性类器官（如肺或肾类器官），为类器官芯片领域的发展开辟了新途径。