基于数字PCR检测胸膜间皮瘤患者胸水上清液中BAP1与MTAP基因拷贝数缺失的诊断价值初探

《Pathology International》：Digital PCR for Detecting Loss of BAP1 and MTAP in Pleural Fluids of Mesothelioma Patients: Perspectives in the Diagnosis

胸膜间皮瘤（Pleural Mesothelioma, PM）常伴随BAP1与MTAP基因的缺失。数字PCR（digital PCR, dPCR）可精确测量基因拷贝数（copy number, CN）。研究人员假设从胸水上清液（supernatant of pleural fluids, SPFs）中提取的游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）能够有效检测这些遗传事件。研究人员采用dPCR对37例PM患者的SPFs及实体肿瘤活检组织（solid tumor biopsies, STBs）中的BAP1/MTAP CN进行测定，并将结果与STBs的免疫组化（immunohistochemistry, IHC）进行比较。单独IHC检测到32/37例（86.5%）存在BAP1/MTAP蛋白缺失。然而，当纳入低BAP1/MTAP CN作为指标后，检出灵敏度提升至34/37例（91.9%）。在20例提供SPFs的患者中，单独dPCR在18份样本中检出低CN（灵敏度=90%）。最终，这一双基因标志物被应用于一组前瞻性连续入组的6例诊断未明（PM阴性）患者，其中2例显示CN降低。经过7个月的随访，这2例受试者因症状持续/加重而再次评估，并被确诊为PM。研究人员强调了dPCR在检测PM患者SPFs中细微BAP1/MTAP缺失方面的潜力。对于高风险患者在IHC分析后获得阴性结果的特定情境下，该方法可作为实现更精准诊断的补充手段。

研究背景、现存问题与研究目的

胸膜间皮瘤（Pleural Mesothelioma, PM）是一种起源于胸膜间皮细胞的罕见侵袭性肿瘤，其主要病因是石棉暴露。PM的组织学亚型包括上皮样型、双相型和肉瘤样型，其中上皮样型最为常见且预后相对较好。尽管手术、化疗和免疫治疗有所进步，但由于诊断延迟和治疗效果有限，PM的总体预后仍然很差。大量PM标本中存在BRCA1相关蛋白1（BAP1）核表达缺失（高达77%）和/或由CDKN2A基因编码的抑癌蛋白p16^INK4A与p14^ARF的缺失（高达80%），这些改变主要由相应染色体区域（3p21.1和9p21）的纯合性缺失或杂合性缺失伴随其他遗传/表观遗传事件导致。

PM的临床表现（如胸痛、呼吸困难、胸腔积液）缺乏特异性，常与其他呼吸系统疾病混淆，使得早期诊断困难。标准影像学技术通常不足以确立诊断，因此需要通过视频辅助胸腔镜获取实体肿瘤活检组织（Solid Tumor Biopsy, STB）进行可靠诊断，但该程序具侵入性，不适用于反复监测。由于超过70%的PM病例伴有可能含有肿瘤细胞的胸腔积液（Pleural Effusion, PE），胸水分析被视为一种微创且更具成本效益的辅助诊断手段。传统细胞学分析的灵敏度虽经改进可达约70%，但仍需结合免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）作为组织学诊断的补充。BAP1表达缺失和/或CDKN2A纯合性缺失在鉴别良恶性间皮增生方面具有极高的特异性，但CDKN2A缺失常用的荧光原位杂交（Fluorescent In Situ Hybridization, FISH）技术要求高且可能产生假阴性/假阳性结果。因此，甲基硫代腺苷磷酸化酶（Methylthioadenosine Phosphorylase, MTAP）蛋白表达的IHC检测被提议作为CDKN2A纯合性缺失的实用替代标志物。

研究人员假设，利用数字PCR（digital PCR, dPCR）测量胸水上清液（Supernatant of Pleural Fluids, SPFs）中BAP1和MTAP的基因拷贝数（Copy Number, CN），可作为常规诊断程序的辅助手段。本研究旨在确定PM患者STBs和SPFs中低BAP1和MTAP CN的发生率，将STBs的dPCR结果与BAP1和MTAP的IHC结果进行比较，并探索不同检测策略的性能。

主要关键技术方法

1. 1.
   样本队列与收集：研究对象为2021年2月至2023年6月期间在比萨大学医院胸外科接受诊断性胸腔镜检查并随后确诊为PM的37例患者（年龄60-87岁，32男5女），以及6例诊断为非特异性炎症（phlogosis）的高风险个体。同时收集了24例健康志愿者的外周血作为对照。
2. 2.
   样本处理：胸腔积液离心分离上清液（SPF）和沉淀；STB样本直接保存。从外周血和STB中提取基因组DNA，从SPF中提取游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）。
3. 3.
   免疫组化（IHC）：使用抗BAP1和抗MTAP抗体对细胞蜡块进行染色，评估蛋白表达状态（阳性P+或阴性P-）。
4. 4.
   数字PCR（dPCR）分析：使用QIAcuity One仪器和QIAcuity Probe PCR Kit，对BAP1和MTAP基因的拷贝数进行定量，以RPP30为参考基因。通过测试健康志愿者和PM患者的外周血白细胞层（Buffy Coat, BC）DNA，确定了区分正常二倍体与低拷贝数的阈值（CN < 1.72定义为低CN，即DL）。

研究结果

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  患者特征、IHC与基因CN检测
  研究人员分析了37例PM患者，其中26例为上皮样型，10例为双相型，1例为肉瘤样型。通过IHC检测STB样本，发现70.3%（26/37）的患者存在BAP1表达缺失，43.2%（16/37）存在MTAP表达缺失。
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  使用IHC或dPCR及其组合检测BAP1和MTAP变异
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    双蛋白IHC标志物（STB）：将BAP1和MTAP IHC结果结合形成双蛋白标志物，至少一种蛋白表达缺失的比例为86.5%（32/37）。
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    双基因dPCR标志物（STB）：使用dPCR在STB中检测BAP1和MTAP的CN，至少一个基因为低CN（DL）的比例为73.0%（27/37）。
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    整合dPCR标志物（STB和/或SPF）：对于有SPF样本的20例患者，当将STB和SPF的dPCR结果整合后，至少一个基因为DL的比例提高至81.1%（30/37）。在可提供SPF的亚组中，单独使用dPCR检测SPF即可识别出90.0%（18/20）的患者为DL状态。
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    IHC与dPCR联合策略：将IHC-STB的双蛋白标志物与整合CN分析相结合，可检测到97.3%（36/37）的患者存在至少一种BAP1/MTAP异常。
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  dPCR与IHC的结果比较
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    对于BAP1，在STB中dPCR与IHC的总体符合率为67.6%，两者关联具有统计学显著性。不一致病例包括dPCR低CN但IHC蛋白表达保留（DLP+）以及dPCR正常CN但IHC蛋白缺失（DNP-）。
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    对于MTAP，在STB中dPCR与IHC的总体符合率为78.4%，两者关联具有统计学显著性。在SPF-dPCR与STB-IHC的比较中，符合率为60.0%，其中大部分不一致为dPCR低CN但IHC蛋白保留（DLP+）。
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  前瞻性小队列概念验证
  研究人员将双基因标志物应用于6例因胸腔积液和石棉暴露史而疑似PM但初始诊断为非特异性炎症的高风险个体。在为期6-26个月的随访中，有2例患者在初次胸腔镜检查约6-7个月后被确诊为PM。值得注意的是，在这2例患者的SPF样本中，早在确诊前就已检测到至少一个基因的低CN（一例BAP1和MTAP均为低CN，另一例MTAP为低CN）。

讨论与结论总结

本研究表明，在PM患者中，基于dPCR的BAP1/MTAP基因拷贝数分析可与传统的IHC检测互为补充。在STB样本中，双基因dPCR标志物的检出率与双蛋白IHC标志物相当。将IHC与dPCR（特别是SPF样本的dPCR）相结合，能将异常检出率从86.5%显著提升至97.3%。在对20例有胸腔积液的PM患者的分析中，单独使用dPCR检测SPF中的cfDNA，其检出率（90%）与STB的IHC检出率（85%）相似甚至更高。

dPCR与IHC之间的不一致（如DNP-和DLP+情况）表明两种方法提供了部分互补的信息。DNP-可能源于不影响CN的点突变或表观遗传改变，而DLP+可能反映了肿瘤异质性或取样差异。重要的是，在SPF中检测到的低CN可能来自肿瘤细胞中纯合性缺失的稀释信号，或杂合性缺失，其本身不应被视为恶性的直接证据，但在高风险患者中可能提示克隆性遗传变异的出现。

前瞻性小队列的概念验证结果极具启发性：两名最初诊断为非特异性炎症的高风险个体，在其SPF中预先检测到了BAP1/MTAP的低CN，并在约6个月后进展为PM。这提示SPF的CN分析可能在风险分层和早期预警中具有潜在价值。

研究结论：研究人员强调，dPCR在检测PM患者SPFs中BAP1和MTAP基因的细微拷贝数缺失方面展现出潜力。对于在接受IHC分析后获得阴性结果的高风险患者，该方法可作为一项补充工具，有助于在特定临床背景下实现更准确的诊断。然而，这些发现仍需在更大规模的前瞻性队列中进行验证，以建立标本特异性的参考范围、诊断特异性、预测价值并确定最合适的临床应用场景。