USP25通过K48连接的去泛素化稳定GLI1并构成相互调节环路促进骨关节炎软骨分解代谢表型

《Clinical and Translational Medicine》：USP25 stabilises GLI1 through K48-linked deubiquitination within a reciprocal regulatory circuit in osteoarthritis models

　　

**背景**：骨关节炎(OA)以进行性关节软骨退变为特征，但有效的疾病修饰靶点仍然有限。在OA进展过程中维持Hedgehog/GLI1信号传导的翻译后修饰机制尚不完全清楚。

**方法**：对GEO数据集进行生物信息学分析，以评估GLI1在OA相关组织区室中的表达。独立的软骨数据集、配对的人软骨标本以及接受梯度IL-1β刺激的原代人软骨细胞提供了组织和细胞层面的相关证据。研究人员采用 unbiased 去泛素化酶(DUB)文库筛选结合GLI1响应性荧光素酶报告基因实验，以鉴定调控GLI1的去泛素化酶。研究人员在体外和体内研究了USP25的分子功能、其与GLI1的相互调节关系，以及AZ1的临床前软骨保护活性和靶点依赖性。

**结果**：OA软骨和原代人软骨细胞中GLI1的失调支持了后续筛选，该筛选将USP25列为机制研究的优先对象。在24名OA患者的配对软骨中，USP25蛋白丰度在肉眼可见的严重退变区域高于相对保留区域，并与GLI1呈适度正相关。USP25直接与GLI1相互作用，去除K48连接的多聚泛素链，并限制其蛋白酶体降解。相互的过表达/敲低功能和救援实验表明，GLI1在很大程度上（但并非 exclusively）介导了USP25相关的炎症和软骨分解代谢表型。反过来，GLI1结合USP25启动子并增强USP25转录，形成了一个相互调节的环路。AZ1在原代人软骨细胞和DMM小鼠中表现出临床前软骨保护活性。USP25沉默后AZ1的残余活性表明其部分依赖USP25。

**结论**：这些发现定义了OA相关模型中USP25生物学的一个以GLI1为中心的机制分支，并为人类OA软骨中USP25-GLI1的协调表达提供了组织水平的支持。USP25-GLI1相互环路有助于软骨分解代谢表型，而AZ1作为药理学探针提供了临床前概念验证。需要进一步研究以确定靶点选择性、长期安全性和临床相关性。

**论文解读文章**：

**研究背景与存在问题**

骨关节炎(OA)是最常见的关节炎类型，也是长期残疾、慢性疼痛和功能受损的主要原因。尽管现有治疗手段包括物理治疗、关节腔内注射、危险因素调整等，但多数方法主要缓解症状，无法可靠地阻止结构进展。因此，识别疾病相关的分子机制和可行的治疗靶点仍是重要的临床需求。OA是一种涉及关节软骨退变、滑膜炎症、软骨下骨异常重塑的全关节疾病。在关节层面，进行性软骨细胞功能障碍和细胞外基质(ECM)稳态丧失是软骨破坏的核心。持续炎症刺激增强软骨细胞分解代谢并抑制基质合成。泛素化与去泛素化是调节蛋白质稳定性、定位和活性的相互对抗的翻译后修饰。越来越多的证据表明，泛素依赖性信号传导的失调通过改变炎症通路和软骨稳态而促进OA。已有多种去泛素化酶(DUB)被牵涉入OA相关过程，其中USP25在IL-1β处理的小鼠软骨细胞中上调，并据报道可通过去泛素化硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)促进NLRP3炎症小体激活和OA进展。然而，USP25是否通过额外的以GLI1为中心的底物和信号分支参与软骨分解代谢表型，以及该DUB与GLI1之间是否存在相互调节并促进疾病进展，仍不清楚。Hedgehog通路及其下游转录因子GLI1已被牵涉入软骨细胞功能障碍和软骨退变。由于GLI1活性受蛋白质转换影响，去泛素化可能是维持Hedgehog信号传导的关键机制。这一知识空白也限制了通过蛋白质稳定性机制间接靶向GLI1的药理学策略开发。

**研究内容与结论**

研究人员结合生物信息学分析、DUB文库筛选和GLI1响应性荧光素酶实验，确定USP25为调控GLI1的去泛素化酶。研究发现，USP25直接与GLI1相互作用，去除K48连接的多聚泛素链，保护GLI1免受蛋白酶体降解。反过来，GLI1转录激活USP25，形成与OA相关模型中炎症和软骨分解代谢变化相关的相互调节环路。机制上，该研究确定了OA相关模型中USP25信号传导的一个以GLI1为中心的调节分支。关节腔内AZ1治疗与减轻内侧半月板失稳(DMM)相关的软骨病理相关，并且在OA样原代人软骨细胞中观察到相关的保护作用。这些发现支持AZ1作为临床前药理学探针的使用，同时进一步定义了OA相关模型中的USP25-GLI1调节机制。该研究的重要意义在于：首次在OA模型中定义了以GLI1为中心的USP25生物学机制分支，提供了人类OA软骨中USP25-GLI1协调表达的组织水平证据，并证明USP25-GLI1相互环路有助于软骨分解代谢表型，同时将AZ1作为药理学探针提供了临床前概念验证。

**主要关键技术方法**

本研究使用了多项关键技术。首先，对GEO数据集(GSE51588作为发现数据集，GSE178557、GSE129147、GSE114007作为独立软骨数据集，GSE1919、GSE12021、GSE55235、GSE55457作为滑膜数据集，GSE300310作为外周血单核细胞数据集)进行生物信息学分析，包括加权基因共表达网络分析(WGCNA)、差异表达分析、基因集富集分析(GSEA)和STRING蛋白-蛋白相互作用网络分析。其次，在SW1353细胞中进行了互补的gain-of-function(8×GTIIC GLI响应性荧光素酶报告基因系统，阈值>2.0倍)和loss-of-function(通过shRNA敲低，以GLI1蛋白丰度<50%为阈值)DUB文库筛选。细胞实验使用原代人软骨细胞、SW1353细胞、ATDC5细胞和HEK293T细胞，采用免疫共沉淀(Co-IP)、GST pull-down、泛素化实验、放线菌酮(CHX)追踪实验、染色质免疫沉淀(ChIP-qPCR)和双荧光素酶报告基因实验。体内实验采用C57BL/6J小鼠和诱导性Usp25^fl/fl; Col2a1-CreERT⁺条件性敲除小鼠，在人软骨样本方面，研究人员获得了24例OA患者的配对软骨标本（根据肉眼形态分为严重退变区和相对保留区）。

**研究结果**

**2.1 GLI1在软骨下骨发现数据集中被提名并在OA软骨和软骨细胞中得到支持**：通过WGCNA分析GSE51588数据集，GLI1在OA软骨下骨中表达升高，并被确定为候选基因。在独立软骨数据集的整合分析中，OA软骨中GLI1表达高于正常软骨(p = 1.9 × 10^-5)。在24例患者的配对软骨中，GLI1在严重退变区域的表达高于相对保留区域。在原代人软骨细胞中，IL-1β以浓度依赖方式增加GLI1、MMP9和MMP13的表达，同时降低COL2A1表达。

**2.2 USP25被优先确定为调控GLI1的去泛素化酶**：通过互补的双向DUB筛选，USP25被确定为目标。USP25过表达或敲低改变GLI1及其下游靶标，但不影响上游调节因子。GLI1 mRNA不受USP25干扰显著影响，而GLI1蛋白丰度显著改变，支持翻译后调控。

**2.3 USP25以去泛素化酶活性依赖方式与GLI1相互作用并稳定之**：免疫荧光显示USP25和GLI1在细胞质中存在部分空间共定位。内源性Co-IP和GST pull-down证实了USP25与GLI1的直接结合。结构域定位实验表明GLI1的235-387氨基酸(ZnF结构域)与USP25的169-657氨基酸(USP结构域)相互作用。催化失活的USP25^C178A突变体不能增加GLI1蛋白丰度。MG132可恢复USP25敲低引起的GLI1水平下降，CHX追踪实验表明USP25延长GLI1蛋白半衰期。

**2.4 USP25从GLI1上移除K48连接的多聚泛素链**：泛素化实验表明，USP25敲低增加总GLI1泛素化，而野生型USP25减少GLI1泛素化，催化失活突变体则无此效应。无细胞去泛素化实验证实纯化的USP25直接去除GLI1的泛素化。连接特异性实验表明USP25优先减少GLI1上的K48连接多聚泛素化。

**2.5 USP25干扰与OA相关模型中的炎症和软骨分解代谢表型相关**：在细胞水平上，USP25敲低降低MMP9和MMP13表达，增加COL2A1表达，并提高细胞代谢活力和DNA合成；USP25过表达则相反。在体内实验中，与他莫昔芬诱导的Usp25^fl/fl; Col2a1-CreERT⁺条件性敲除(Usp25-cKO)小鼠相关的DMM软骨病理减轻。在24例患者配对软骨中，USP25蛋白丰度在严重退变区域更高，Spearman相关分析显示USP25与GLI1蛋白丰度呈适度正相关(r = 0.43, p = .037)。

**2.6 GLI1在很大程度上但不完全地介导了USP25相关表型**：在SW1353细胞、ATDC5细胞和原代人软骨细胞中，GLI1过表达部分逆转了USP25敲低引起的MMP9减少和细胞代谢活力变化。反之，GLI1敲低减弱但未完全消除USP25过表达引起的MMP9增加和细胞代谢活力降低。在DMM小鼠中，关节腔内GLI1过表达部分恢复了Usp25-cKO小鼠中MMP9染色的减少。这些结果表明GLI1介导了USP25相关表型的实质性但不排他性组分。

**2.7 GLI1正向调控USP25转录**：GTRD数据库显示USP25是GLI1的潜在转录靶基因。GLI1沉默降低USP25蛋白和mRNA水平。HOCOMOCO v13分析预测了USP25启动子中的三个候选GLI1结合位点(R1, R2, R3)。定点突变和ChIP-qPCR实验确定R3为功能性的主要GLI1响应位点，GLI1通过该位点增强USP25转录。

**2.8 AZ1的软骨保护活性和探索性靶点依赖性分析**：AZ1在细胞水平上降低MMP9和MMP13蛋白水平，增加COL2A1表达并提高细胞活力。在DMM小鼠模型中，关节腔内AZ1治疗与减轻的组织学软骨损伤、降低的OARSI评分和骨赘评分相关，并伴有MMP9、MMP13和COL2A1染色的相应变化。在原代人软骨细胞中，USP25敲低显著复制了AZ1相关表型，而USP25敲低后AZ1的残余响应表明部分USP25依赖性。相比之下，USP28敲低既不能复制AZ1表型，也不能消除其对AZ1的响应，表明USP28不是AZ1相关表型的主要介导者。

**总结讨论与结论翻译**

**讨论总结**：本研究确定GLI1为USP25相关底物，证明USP25通过去除K48连接的多聚泛素链来稳定GLI1，并提出GLI1可反向增强USP25转录的证据。配对人类软骨标本中的USP25-GLI1适度正相关支持了组织水平的协调表达。研究人员提出USP25-GLI1环路应被视为USP25生物学在测试的OA相关模型中的一个机制分支，而非其全部机制。既往报道的USP25-TXNIP-NLRP3通路可能与USP25-GLI1通路共存，但功能层级和相互关系尚未解决。与其他OA相关DUB的比较表明DUB活性在OA中并非统一具有保护性或致病性，其生物学效应取决于底物、泛素连接类型和信号通路。GLI1作为转录因子缺乏易靶向的药物结合口袋，因此靶向其稳定性调控蛋白可能更为可行。AZ1作为USP25/USP28双重抑制剂，在原代软骨细胞中部分依赖USP25，而USP28并非主要介导者。研究存在多个局限性，包括发现数据集的初始组织不匹配、缺乏人OA组织的IHC/IF定位和单细胞/空间转录组分析、条件性敲除模型对照组未匹配他莫昔芬处理、AZ1的体内靶点依赖性未在Usp25-cKO小鼠中直接验证等。

**结论翻译**：总之，研究数据确定了以GLI1为中心的机制分支，其中USP25从GLI1上移除K48连接的多聚泛素链并限制其蛋白酶体降解，而GLI1增强USP25转录。在测试的OA相关模型中，这种相互环路与炎症和软骨分解代谢表型相关。配对的人类软骨发现为OA关节内USP25-GLI1的协调表达提供了组织水平的支持，而进一步的临床注释和空间分辨研究将有助于确定其人类相关性。AZ1在测试的细胞和DMM模型中表现出临床前药理学活性，在此被解释为具有部分USP25依赖性的概念验证药理学探针。需要进一步研究以确定靶点选择性、长期安全性和转化相关性。