翻译后修饰表位在自身免疫中的发现：总得有人去捕捞，大家才有得吃

《Immunological Reviews》：Discovery of Post-Translationally Modified Epitopes in Autoimmunity: Someone Has to Fish so Everyone Can Eat

翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）将约20,000个基因组编码蛋白化学多样化，产生数百万种功能性变体，这种多样性对T细胞介导的免疫应答具有深远影响。PTM反应性T细胞已在多种自身免疫疾病中被鉴定，并在若干病例中被直接证实为致病驱动因素。机制上，PTMs通过两条相互交织的途径促进自身免疫：一是改变肽段–MHC及TCR结合，从而有利于识别自身表位；二是在外周和/或炎症组织中产生胸腺中缺失的新表位，使PTM反应性T细胞得以逃逸中枢耐受。这一级联反应被炎症性细胞因子、上调的抗原加工机制、疾病相关HLA等位基因以及在某些情况下的外源性触发因素（如饮食）所放大。研究人员利用三个特征明确的实例——多种自身免疫疾病中的瓜氨酸化（citrullination）、1型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）中的杂合胰岛素肽（hybrid insulin peptide，HIP）形成以及乳糜泻（celiac disease，CeD）中的谷蛋白脱酰胺（gluten deamidation）——来说明不同的PTM生物学、组织特异性和遗传可编码性如何塑造抗原景观并决定可行的发现策略。随后，研究人员综述了四种鉴定PTM特异性T细胞应答的互补方法：基于质谱的蛋白质组学和免疫肽组学（immunopeptidomics）、计算MHC结合预测、抗原导向方法以及高通量T细胞受体（T cell receptor，TCR）导向文库筛选方法。针对每种方法，研究人员讨论了其基本原理、优势和局限性，特别关注非经典PTM携带残基所带来的挑战。通过在这四种方法学框架下比较瓜氨酸化、HIPs和谷蛋白脱酰胺，研究人员阐明了生化改变、组织可及性以及小鼠到人类的保守性如何决定哪种发现策略最为可行。研究人员得出结论：虽然基于合成肽段的方法仍是验证已知表位的标准手段，但新兴的高通量、基于细胞的平台正在迅速拓展PTM抗原景观在已知和未发现的自身免疫表位方面的可及性。

论文主体内容总结

1 T细胞应答的抗原景观

T细胞通过表面T细胞受体（TCR）识别由经典或非经典主要组织相容性复合体（MHC）分子（在人类中称为人类白细胞抗原（HLA）分子）呈递的肽段和非肽段表位。CD8+ T细胞识别存在于几乎所有有核细胞上的I类MHC中的表位，而CD4+ T细胞识别存在于专职抗原呈递细胞（APCs）上的II类MHC中的表位。据估计，单个细胞表面呈递10⁴–10⁵个I类分子，而专职APC可呈递10⁵–10⁶个II类分子，相当于每个细胞呈递10⁵–10⁶个独特肽段表位。T细胞通过V(D)J重组产生大量独特的TCR来应对这种多样性，个体免疫系统中通常有10⁶–10⁹个独特TCR。

单细胞和批量TCR测序方法、蛋白质组学和免疫肽组学方法取得了显著进展。蛋白质在整个生命周期中经历多种翻译后修饰（PTMs），包括磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化和泛素化等。PTMs可通过化学非酶促过程（如氧化、氨甲酰化）或特定酶促反应（如甲基化、乙酰化、瓜氨酸化）引入。PTMs将细胞蛋白质组从约20,000个基因组编码蛋白扩展至数百万种功能性蛋白变体。

PTM特异性免疫应答在自身免疫和癌症中已被充分证实。机制上，PTMs通过两条途径驱动自身免疫：一是改变表位与MHC和/或TCR的结合，增加刺激T细胞的可能；二是增加PTM反应性T细胞逃逸中枢耐受的可能，因为PTMs通常在外周组织应激和/或炎症条件下诱导产生，而胸腺中不存在。这一级联反应被多种过程放大，包括炎症性细胞因子上调促进PTMs的酶和化学过程、炎症诱导的抗原加工和呈递途径上调、食物抗原和病毒感染等外源性因素、高度细胞类型特异性的基因程序、对修饰表位具有偏好的MHC/HLA等位基因，以及I类和II类MHC表达的差异模式。

1.1 瓜氨酸化

瓜氨酸化被广泛认为是最具特征性和最令人信服的自身免疫免疫原性PTM实例。在类风湿关节炎（RA）中，抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）作为高度特异性生物标志物，与疾病进展和严重程度相关。瓜氨酸化涉及精氨酸不可逆地转化为非经典氨基酸瓜氨酸（R?Cit），由肽基精氨酸脱亚胺酶（PAD）酶家族介导。PAD酶是钙依赖性的，基础活性较低；但急性和慢性炎症可破坏钙稳态，导致异常和广泛的蛋白瓜氨酸化。RA最强的遗传风险因素是某些HLA-DRB1等位基因的遗传，其编码DRB链70–74位的保守氨基酸基序，即共享表位，赋予肽结合槽对中性瓜氨酸而非带正电荷精氨酸的偏好。因此，瓜氨酸化肽段可能以更高密度呈递在APCs上，在MHC/HLA分子上更稳定，更可能激活自身反应性CD4+ T细胞。瓜氨酸化新表位还见于多发性硬化症、系统性红斑狼疮（SLE）、银屑病和T1D等疾病中。

1.2 杂合胰岛素肽的形成

HIPs是一类翻译后形成的新表位，当胰岛素肽段片段与其他β细胞分泌蛋白片段融合时产生。该过程高度特异于β细胞，依赖于组织蛋白酶介导的β细胞蛋白切割以及分泌颗粒与内溶酶体融合时产生的低pH条件。由于HIPs不在胸腺中形成，对其反应的T细胞可逃逸中枢耐受。HIP反应性T细胞在胰腺淋巴结中被刺激，诱导致病性促炎表型。NOD小鼠中多种致糖尿病CD4+ T细胞克隆（最著名的为BDC2.5和BDC6.9）被证实是HIP反应性的，且足以通过过继转移诱导糖尿病。此后HIPs被确立为T1D中真正的驱动抗原。

1.3 谷蛋白脱酰胺

组织特异性翻译后谷蛋白脱酰胺已被证实在乳糜泻（CeD）中具有致病性。CeD是一种由谷蛋白不耐受引起的自身免疫性疾病。肠道病理由组织转谷氨酰胺酶2（TG2）修饰谷蛋白（主要来自小麦、大麦和黑麦的α-麦胶蛋白）驱动，其中谷氨酰胺残基转化为谷氨酸残基（Q?E）。脱酰胺的α-麦胶蛋白肽段导致肠道相关APCs呈递新表位。脱酰胺表位尤其被某些HLA等位基因（如HLA-DQ2.5和DQ8）良好呈递。由于这些表位不在胸腺上皮细胞中表达，识别它们的T细胞可逃逸中枢耐受。针对脱酰胺麦胶蛋白的CD4+ T细胞主要偏向促炎性T辅助1型（Th1）表型，通过干扰素-γ（IFNγ）和白细胞介素-15（IL-15）造成肠道黏膜损伤并促进炎症环境，进而上调TG2。膳食谷蛋白回避足以预防CeD发作，凸显了脱酰胺谷蛋白的关键作用。

2 蛋白质组学和免疫肽组学

2.1 蛋白质组学

基于质谱（MS）的蛋白质组学是检测PTMs的金标准。典型流程包括胰蛋白酶消化、液相色谱（LC）分离、MS1扫描精确质量测量和MS2/3碎裂产生序列信息碎片谱，再与参考数据库匹配。常规蛋白质组学可根据修饰引起的质量/电荷变化区分修饰氨基酸与其未修饰对应物。对疾病影响组织的蛋白质组学分析在鉴定PTMs方面发挥了关键作用。例如，Delong等人对小鼠β细胞提取物进行蛋白质组学分析，鉴定出胰岛素C肽（InsC）和嗜铬粒蛋白A（ChgA）肽段片段，证实了HIPs在β细胞中的存在。后续研究检测到小鼠和人类β细胞提取物中数千种HIPs，并鉴定出组织蛋白酶D和组织蛋白酶L是产生HIP片段的主要蛋白酶。

质谱鉴定PTMs面临两个主要挑战。第一，许多生物学上不同的修饰产生几乎相同的质量位移，如脱酰胺和瓜氨酸化均诱导+0.984 Da的位移，三甲基化（+42.047 Da）与乙酰化（+42.011 Da）非常相似。这需要高分辨率和高质量精度的MS仪器。第二，重复序列使得难以将PTM分配给正确的残基或区域，如CeD中33-mer免疫显性α-麦胶蛋白肽含有六个重叠的近乎相同的脯氨酸/谷氨酰胺富集基序重复。

2.2 免疫肽组学

免疫肽组学是对MHC结合肽段的窄化和聚焦的蛋白质组学搜索。由于MHC/HLA分子通过非共价键结合肽段，可通过免疫沉淀提取pMHC复合物，再用温和酸处理释放肽段。与传统蛋白质组学不同，肽段洗脱过程中不使用胰蛋白酶消化，保留了表位在MS前的生理状态。免疫肽组学分析已用于多种情境下的PTM谱分析。例如，对狼疮倾向MRL/lpr小鼠的I-E^k限制性表位分析鉴定出1382个肽段，PTM聚焦搜索发现来自59个蛋白的82个瓜氨酸化肽段。对NOD小鼠或T1D供体胰岛的独立免疫肽组学分析显示了大量保守来源蛋白，瓜氨酸化和脱酰胺等PTMs在两个数据集中均被鉴定。

2.3 PTM搜索的数据分析流程

肽段水平MS数据可通过数据依赖性采集（DDA）或数据非依赖性采集（DIA）获取。DIA正越来越多地被采用，因其更彻底地采样m/z扫描空间，可提高低丰度HLA结合肽段的灵敏度和重现性。光谱匹配通过数据库搜索进行。封闭搜索预先指定预期修饰列表，但任何未包含在搜索参数中的修饰都将无法检测。开放（质量容忍）搜索扩展了有效搜索空间，通过鉴定带有已知或未预期修饰以及序列变体质量位移的肽段来减少未解释光谱的数量。

免疫肽组学存在若干局限性。它可能仅分析实际免疫肽组中不到1%的部分，典型实验每样本产生数百至数千个肽段，仅数十至数百个检测到PTMs。获得足够数量的疾病相关组织或APCs可能不可行。此外，蛋白质组学PTM谱分析和免疫肽组学本质上是静态快照，无法推断PTM的动态变化。

3 MHC结合预测

已开发多种计算工具用于预测人和小鼠等位基因的肽段–MHC结合。NetMHCpan-4.1和NetMHCIIpan-4.0是最广泛使用的I类和II类结合泛特异性预测器，MHCflurry是开源替代方案。MixMHCpred和MixMHC2pred使用基序反卷积策略，MHCSeqNet2专注于等位基因数据有限时的预测改进。免疫表位数据库（IEDB）截至2026年6月拥有超过100万个MHC结合肽段，其中约46,000个含有乙酰化、瓜氨酸化、半胱氨酸化、脱酰胺、甲基化、硝化或磷酸化等修饰。

早期预测工具使用位置特异性评分矩阵，较新工具主要依赖神经网络建模MHC结合，学习锚定残基模式。MHC结合预测对常见、特征明确的等位基因准确性较强，I类MHC优于II类，预测质量与给定等位基因的训练数据量直接相关。最近开发的交互语言模型（iLM）SWING学习pMHC相互作用的更广义表征，即使对从未见过的等位基因也能保持合理的预测准确性。

MHC结合预测算法通常限于经典氨基酸。它们可用于HIPs和脱酰胺（产生仅含经典序列的表位），但无法用于瓜氨酸化等PTMs。目前唯一能预测PTM表位的算法聚焦于磷酸化，如PhosMHCpred、NetMHCphosPan和NetMHCIIphosPan，揭示了磷酸化残基在结合基序位置4的强烈偏好。

4 抗原导向发现

抗原导向方法询问给定一组候选抗原，能否鉴定对其反应的T细胞。其优势包括高灵敏度检测（低至每百万T细胞中一个表位特异性细胞）、无需高度专业技术、提供免疫应答的定量读数以及能够检测大型多克隆库。

4.1 可溶性pMHC多聚体试剂

可溶性pMHC复合物可被荧光标记并多聚化，用于流式细胞术检测T细胞。pMHC多聚体染色高度灵敏，可检测低至0.01%的抗原特异性T细胞频率，并允许分选抗原特异性T细胞进行单细胞分析。pMHC四聚体已广泛用于瓜氨酸化表位（RA和T1D）、麦胶蛋白表位（CeD）和HIPs（T1D）的T细胞反应谱分析。其局限性包括通量极低（通常少于10个表位）、四聚体生成技术方案复杂费力、II类四聚体试剂高度不稳定。

4.2 功能测定

功能测定依赖T细胞对其同源表位的高灵敏度和特异性，以及识别APCs上表位后表面标志物和细胞因子的快速上调。多克隆T细胞库与单个或混合合成肽段共孵育，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）、酶联免疫斑点（ELISPOT）、细胞内细胞因子染色或激活诱导标志物（AIM）测定测量功能应答。这些读数通常简单、廉价，可同时处理多个样本，可粗略检测多达数百个肽段的反应性。局限性包括规模仍限于数百个肽段、功能读数可能无法反映真实定量（尤其当抗原特异性细胞因耗竭或无反应性而功能低下时）、以及大多数功能测定提供的生物学见解有限。

5 TCR导向发现

TCR导向方法通常不需要候选抗原的先验信息，而是询问给定T细胞克隆或感兴趣的TCR，能否鉴定其同源表位。这些方法针对单个或少量TCR筛选大量表位库。

5.1 组合肽段文库

位置扫描合成组合文库（PS-SCL）构建为一组肽段混合物，其中一个位置固定为单一氨基酸，其他位置包含多种/所有氨基酸的等摩尔混合物。通过测试T细胞或TCR对每个混合物的反应，可推断出共有识别基序。PS-SCL的优势在于无需抗原先验知识，可探索整个搜索空间。主要缺点是常鉴定出模拟表位（刺激TCR但非实际生理表位的表位）。BDC2.5 TCR的PS-SCL分析鉴定出p31模拟表位（YVRPLWVRME），揭示了WXRM(D/E)基序，该基序后来在生理性HIPs中被发现。

5.2 酵母展示

酵母展示通过工程化酵母细胞在表面表达pMHC复合物文库，其中肽段与MHC共价连接，从而实现遗传编码。将可溶性荧光标记TCR与酵母文库孵育，通过FACS分选结合TCR的酵母，经多轮分选和再生长后，对分选酵母的肽段编码DNA进行测序以揭示候选表位。酵母展示已用于肿瘤浸润淋巴细胞和自身免疫中TCR的特异性解析。其局限性包括需要工程化单个MHC等位基因以增强稳定性、需要产生可溶性TCR，且尚未应用于PTMs研究。

5.3 基于细胞的文库

Elledge实验室开发的TScan和TScan-II平台使用工程化靶细胞表达全基因组ORF衍生肽段片段文库，通过颗粒酶B激活荧光报告基因来鉴定被TCR识别的细胞。另一种方法使用遗传和共价连接至MHC的肽段构建pMHC复合物，在细胞表面表达并呈递所需肽段库。本实验室开发了信号和抗原呈递双功能受体（SABRs），将pMHC复合物与CD28-CD3ζ信号域融合，在NFAT-GFP-Jurkat报告细胞中表达。利用NOD小鼠I-A^g7结合肽段的免疫肽组学数据集构建了4075个表位的SABR文库，成功鉴定了BDC2.5 TCR的同源表位，包括p31模拟表位和2.5HIP及其相关表位。随后利用该文库对NOD小鼠胰岛浸润CD4+ T细胞中克隆扩增的前35个TCR中的10个进行去孤儿化，其中6个识别InsC-ChgA或InsC-IAPP HIPs。基于蛋白质组学数据集构建了2561个推定HIPs的文库，成功鉴定了先前去孤儿化失败的TCR所识别的多个HIPs。这是首个高通量HIP聚焦抗原发现方法。

TCR导向方法在经典氨基酸之外的PTM分析能力上显著受限。PhIP-Seq（噬菌体免疫沉淀测序）被改造用于ACPA的瓜氨酸化靶标分析，通过PAD酶处理将精氨酸转化为瓜氨酸。磷酸化模拟氨基酸（天冬氨酸或谷氨酸）可模拟磷酸基团的负电荷，但可能无法完全模拟TCR结合。