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超分辨率荧光显微镜已发展至能够以纳米精度解析分子尺度组织的阶段。在此背景下，成像数据的准确解读越来越依赖于定义明确的校准标准。纳米尺已成为验证分辨率、量化标记性能以及基准测试分析方法的重要工具。当前的方法包括基于DNA、基于蛋白质和基于病毒的纳米尺，每种方法在
超分辨率荧光显微镜已发展至能够以纳米精度解析分子尺度组织的阶段。在此背景下，成像数据的准确解读越来越依赖于定义明确的校准标准。纳米尺已成为验证分辨率、量化标记性能以及基准测试分析方法的重要工具。当前的方法包括基于DNA、基于蛋白质和基于病毒的纳米尺，每种方法在可编程性、结构定义和生物学相关性方面各有独特优势。本小型综述概述了这些互补策略，重点关注近年来通过蛋白质工程和位点特异性标记技术进展所推动的基于蛋白质的纳米尺的最新发展。这些方法共同为建立可靠的定量分子生物成像校准框架做出了贡献。
1 引言
自受激发射损耗（STED）显微术发明以来，光学显微领域在过去三十年间经历了巨大变革。然而，先进成像模式的快速普及对可靠、可重复且易用的校准标准（即“纳米尺”）提出了更高需求，用以验证成像性能并确保跨系统一致性。早期研究中常使用随机固定的单荧光团或荧光珠等简单样本评估成像性能，但难以检测细微偏差或重建伪影，因为异质或随机样本中荧光标记的真实空间分布极难先验确定。这促使研究者开发具有预定几何结构和可控标记模式的工程化纳米尺，为成像性能提供实验可获取的地面真值。随着新型超分辨率模态将空间分辨率推进至个位数纳米乃至亚纳米级别，对高度稳定、刚性且化学计量精确的校准纳米尺的需求愈发迫切。本综述全面介绍了当前纳米尺制备的最先进方法，聚焦于DNA折纸架构、蛋白质支架和自组装病毒颗粒三大平台，并根据结构刚性、标记效率和制备简便性对其进行了评估。
2 基于DNA的纳米尺
Rust等在开创性工作中使用双链DNA（dsDNA）作为纳米尺，将Cy3-Cy5对结合到特定碱基上并固定在玻璃表面。但这并非理想标准：此类构建局限于一维，dsDNA固有的柔性使其无法精确预知染料间距离，且三维取向不可预测导致二维投影距离偏离设计值。DNA纳米技术的快速发展提供了解决方案，其中DNA折纸技术尤为关键。该技术通过热退火使闭合单链DNA（脚手架链）在大量短链DNA（订书钉链）作用下折叠成预设的二维或三维结构，可在数小时内并行获得数十亿个结构，无需复杂设备。自2009年起，DNA折纸成为超分辨显微领域验证新成像技术的金标准。研究者可在宽动态范围内（从<1 nm到数百纳米）将任意数量的荧光团或DNA-PAINT停靠位点排列在预设三维位置上。超分辨方法可通过验证工程化位点是否可分辨来评估空间分辨率，并通过比较测量距离与设计值来评估准确性。DNA折纸结构可通过生物素-亲和素化学作用以明确定向固定于玻璃表面，残余误差通常约为0.5-1 nm。几乎所有超分辨方法都已利用DNA折纸标准展示其能力——从早期DNA-PAINT实现130 nm目标距离的分辨，到现代MINFLUX或RASTMIN实现1-2 nm定位精度，乃至RESI和MINSTED最近展示的埃级分辨率。三维DNA折纸结构也成为评估轴向成像性能的理想靶标。此外，DNA折纸还推动了超分辨测量的信息扩展：结合偏振依赖的单分子荧光测量可确定荧光团相对于宿主纳米结构的取向；利用qPAINT可实现绝对分子计数；通过布置抗原并对比不同标记策略可直接量化连接误差；在高度多重成像中，DNA折纸被用于验证二级标记策略的杂交效率和空间分辨率。DNA折纸还在亚纳米漂移校正和色差校正中发挥重要作用。在低成本便携式系统中，DNA折纸标准也成功验证了约84 nm的定位精度。总之，DNA折纸技术为验证超分辨显微领域的重大突破提供了无与伦比的平台，其出色的可编程性、多功能性、结构稳定性和成本效益使其将继续成为未来超分辨模态发展的关键支撑。
3 基于蛋白质的纳米尺
基于蛋白质的纳米尺在全合成DNA纳米结构与内源性细胞参考靶标之间占据了关键中间地带。经典生物参考结构（如核孔复合体和微管）虽提供天然蛋白架构，但其几何结构固定且受限于探针尺寸和显著连接误差。DNA折纸则因体外组装和对复杂细胞内环境的有限兼容性而受限。基于蛋白质的纳米尺得益于蛋白质生物化学、结构生物学和分子工程的长期积累，能够以前所未有的精度进行从头设计、表达和位点特异性功能化。基因密码子扩展（GCE）技术能以最小空间位移引入位点特异性化学手柄，随后通过生物正交化学连接荧光团、亲和标签或DNA-PAINT停靠链，使其兼容多种荧光模态。理想的蛋白质纳米尺需满足严格条件：刚性明确的构象、位点特异性定量标记、以及良好的生化稳定性。首个经实验验证的基于蛋白质的纳米尺是基于增殖细胞核抗原（PCNA）的PicoRuler——同源三聚体PCNA环提供刚性支架，通过GCE在每个原聚体中引入一个非天然氨基酸，形成三个相距约6 nm的生物正交标记位点。其固定三聚对称性限制了独立调控荧光团数量和间距的能力。这一局限最近被利用环状串联重复蛋白（cTRP）作为可编程下一代PicoRuler所解决。cTRP是全新设计的蛋白环，外径约10 nm，其表面暴露的可修饰环可通过GCE和生物正交标记携带1、2、3、4或6个标记位点，预设间距约3.3-8.9 nm。cTRP PicoRuler还被扩展到膜展示和膨胀显微（ExM）场景。其他研究展示了模块化蛋白梯用于标准化FRET检测，以及利用自组装蛋白纳米笼确定局部纳米尺度膨胀因子。基于蛋白质的纳米尺已从固定天然寡聚体发展为可编程、模态特异性的参考系统，在需要类蛋白质环境、基因编码呈现或与细胞及膨胀成像兼容的场景下补充了DNA折纸。
4 基于病毒的纳米尺
病毒颗粒因其卓越的稳定性、可重复性和生物相容性而成为极具吸引力的超分辨光学显微纳米尺支架。病毒具有精确的纳米尺度架构和显著的物理化学稳定性，通常呈螺旋或二十面体等高对称构型，由一种或少数几种衣壳蛋白的多拷贝组成，可通过遗传修饰实现精确灵活的荧光标记。虽然烟草花叶病毒（TMV）早已用作电子显微镜的距离校准标准，但荧光显微领域一直缺乏类似的通用生物基准。噬菌体T4最近被引入作为“3D-Bio-NanoRuler”。该非致病性病毒可在BSL-1条件下安全操作，易于商业获取和高产量培养。其结构特征为约260 nm的火箭形架构，包含包裹基因组DNA的细长二十面体头部和可收缩圆柱形尾部。研究者开发了简化的样品制备方案，通过真空干燥后复水及化学固定使病毒垂直排列在白蛋白包被的玻璃表面，从而可以同时清晰聚焦地成像数百个噬菌体，且绝大多数呈现垂直于盖玻片的均匀取向。这种精确对齐结合病毒固有的轴向不对称性，使其成为特别适合三维超分辨成像的校准标准。研究采用三维DNA-PAINT，利用一抗和二级纳米抗体标记整个病毒颗粒及特定结构衣壳蛋白。通过直接空间测量和粒子平均方法表征了长椭圆形衣壳的尺寸（宽度100 nm，长度132 nm），与考虑约7 nm连接误差后的预期结构值吻合良好。顶点蛋白gp24的空间分布测量结果也与T4二十面体面的已知尺寸一致。T4病毒颗粒拥有超过40种独特的结构蛋白，展现了多靶标潜力，便于多通道校准和内部一致性检查。双色Exchange 3D DNA-PAINT成像揭示了颈部相关纤维蛋白gpwac的亚衣壳定位和领圈样组织。T4穿透真核细胞的已证实能力提示其可能作为细胞内生物纳米尺用于细胞内超分辨成像。研究还提出了针对四种主要衣壳蛋白的替代标记策略以最小化连接误差，例如通过GCE标记间隔14 nm的辅助蛋白Hoc和Soc，或靶向间隔4.8 nm的gp24同源五聚体和间隔4.5 nm的gp23同源六聚体的顶端突起，这将使得在所有三个维度上严格验证个位数纳米分辨率成为可能。
5 结论与未来展望
随着荧光显微术突破个位数纳米壁垒并进入埃级分辨率时代，定量成像数据的绝对可靠性已从硬件限制转变为校准挑战。三种不同的纳米尺模态构成了强大的互补工具箱，各自存在基本的生物物理权衡。DNA折纸在几何灵活性、商业化可用性和多通道条形码方面无与伦比，但结构柔性和与天然细胞内环境的兼容性较差。基于蛋白质的纳米尺（如PCNA或cTRP PicoRuler）通过GCE和生物正交点击化学实现了最小连接误差、确定的化学计量和可编程价态与几何结构，但多位点整合和均质标记在技术上仍有难度。基于病毒的纳米尺（如噬菌体T4）具有卓越的物理稳定性、固有的三维轴向不对称性和高多靶标密度，但较大的物理足迹可能导致空间位阻，且细胞内实施和结构稳定性尚待建立。所有三个平台的统一主题是解耦光学显微镜的内在分辨能力与标记策略引入的空间位移（连接误差）。蛋白质和病毒基纳米尺通过从传统抗体复合物转向GCE结合生物正交点击化学，直接将小分子有机染料附着到蛋白质骨架上，确保测量的光学坐标反映真实的大分子标准坐标。未来，基于蛋白质的纳米尺的前沿在于进一步扩大可编程标准的几何多样性和生物学适用性，计算蛋白质设计的进步可能将其扩展到定制化的三维架构、表面化学和细胞靶向。同时，利用T4等病毒架构被真核细胞内化的能力，为开发细胞内生物纳米尺开辟了令人兴奋的途径，使研究者能够在活细胞内绘制、量化和校正异质性折射率变化、分子拥挤和局部细胞内运动。
