基于单份尿样的6-氧代雄烯二酮与睾酮滥用的碳同位素同步确证策略

《Drug Testing and Analysis》：A Single-Aliquot Strategy for Simultaneous Carbon Isotope Confirmation of 6-Oxo-Androstenedione and Testosterone Misuse in Doping Control

一种符合世界反兴奋剂机构（WADA）要求的方法被验证可用于碳同位素比值（CIR）分析，从而能够从单份尿液样本等分试样中同时确证6-氧代雄烯二酮（6-oxo）代谢物与睾酮类固醇谱标志物。该方法能够在运动员样本中检出6α-羟基-雄-4-烯-3,17-二酮（6α-OH，即6-oxo或睾酮前体激素滥用标志物）时，区分内源性与外源性类固醇来源。CIR分析工作量大且通常需要大量样本体积。因此，本研究旨在验证一种能够从单份样本等分试样中同时完成两项确证的方法。基于先前已验证的睾酮确证方法，研究人员将6α-OH、其6β-差向异构体以及6-oxo纳入并验证为6-oxo摄入的标志物。该提议方法以两步液相色谱纯化为基础，所获得的峰纯度足够、同位素分馏可忽略不计，且振幅适合典型线性范围内的CIR类固醇分析。6α-和6β-OH的定量限为5.0 ng/mL，6-oxo为15 ng/mL，其合成不确定度分别为0.6‰、0.5‰和0.4‰。应用于真实样本的结果表明，该方法在区分阴性样本与阳性样本方面具有良好的适用性。总体而言，结果表明所有WADA方法验证要求均已满足，并且所提出的在单一分析流程中同步进行6-oxo与睾酮标志物CIR分析的策略是成功的。

论文解读：基于单份尿样的6-氧代雄烯二酮与睾酮滥用的碳同位素同步确证策略

一、研究背景与现存问题

6-氧代雄烯二酮（6-oxo）是一种外源性芳香化酶抑制剂，可通过阻止雄激素向雌激素转化来预防男性乳房发育症（合成代谢类固醇滥用的副作用），同时维持较高的雄激素水平，因此被列入世界反兴奋剂机构（WADA）禁用清单。在兴奋剂检测中，6α-羟基-雄-4-烯-3,17-二酮（6α-OH）被认为是6-oxo滥用的最佳标志物。然而，6α-OH也可能作为雄-4-烯-3,17-二酮（AD）的次要代谢产物存在于尿液中，AD既可以是内源性睾酮（T）的前体，也可能是外源性合成T前体激素滥用的产物。此外，6-oxo本身及其另一代谢物6β-羟基-雄-4-烯-3,17-二酮（6β-OH）也可能因微生物降解内源性脱氢表雄酮而出现。因此，当运动员样本中6α-OH浓度高于10 ng/mL时，需要进行气相色谱/燃烧/同位素比质谱法（GC/C/IRMS）确证分析，以区分其来源。

现有挑战在于：对于一份可疑样本，可能需要对类固醇谱标志物（用于T滥用确证）和6-oxo标志物分别进行两次独立的CIR分析，这需要消耗大量样本体积，而实验室往往无法获得如此充足的尿样。此前虽有关于6α-OH的CIR分析方法报道，但要么不符合现行WADA要求，要么未能实现与T标志物的同步分析。因此，本研究的目标是开发并验证一种方法，使实验室能够从单份尿样等分试样中同时完成对T和6-oxo两类标志物的CIR确证，优化工作流程并减少样本消耗。

二、研究方法概述

研究人员基于此前已验证的T确证方法进行了改进。主要技术流程包括：采用固相萃取（SPE）对25 mL尿液进行初步净化；通过液-液萃取分离游离态的6-oxo；对水相进行酶水解后再次提取糖苷结合态类固醇；随后进行两步高效液相色谱（HPLC）纯化，第一步收集包含6α-OH和6β-OH在内的多个组分，第二步进一步分离纯化各目标化合物，并在两步HPLC之间引入乙酰化衍生步骤；最终采用GC/C/IRMS进行碳同位素比值测定，同时连接单四极杆质谱仪评估峰纯度。方法验证严格遵循WADA技术文件要求，包括仪器线性、工作范围、定量限（LOQ）、中间精密度、偏倚和合成不确定度（u_c）的评估。研究使用了来自巴西兴奋剂控制实验室（LBCD）的阴性样本以及一名接受治疗性睾酮替代给药（十一酸睾酮注射液，Nebido 250 mg/mL）的男性志愿者提供的5份样本进行方法适用性测试。

三、研究结果

3.1 HPLC纯化

该方法采用两步HPLC纯化加中间乙酰化的处理方案，尽管耗时较长，但成功地将T和6-oxo确证所需的每种化合物分离到各自独立的组分中，无显著干扰，且峰强度足以满足CIR分析。第一步HPLC从糖苷结合物组分中同时收集了T标志物和内源性参比化合物（ERC），并将6α-OH和6β-OH合并收集到一个单独的瓶中；游离组分则在同一条件下运行以分离6-oxo。第二步HPLC针对6-oxo标志物进行了优化，实现了6α-和6β-差向异构体的充分分离，并消除了第一步HPLC中观察到的大量基质干扰。窄收集窗口的使用由内标的高保留时间稳定性保障，避免了部分峰丢失和同位素分馏。

3.2 6-Oxo的乙酰化

尽管6-oxo缺乏羟基基团，但初步实验表明其通过酮-烯醇互变异构后发生乙酰化，形成了一种单一的衍生物，质谱显示分子离子峰m/z 342。经校正乙酸基团的贡献后，比较乙酰化前后6-oxo的CIR值，未发现与烯醇中间体形成相关的显著同位素分馏。

3.3 CIR分析

GC/C/IRMS色谱图显示，对于加标样本，6α-OH、6β-OH和6-oxo均获得了干净的基线、纯净的峰形和足够的峰高。通过同时采集的全扫描质谱图与阳性质量控制品对比，直接和反向相似度评分均大于900，确认了峰的纯度和特异性，满足了WADA的所有鉴定标准。6β-OH组分中存在一个未知内源性干扰峰，通过在其洗脱后立即激活反吹阀来防止其影响燃烧反应器。

3.4 仪器线性、工作范围和定量限

仪器线性范围评估结果显示，6α-OH、6β-OH和6-oxo的线性范围分别为315-4829 mV、291-4794 mV和200-3469 mV，各水平最大标准差（SD）和整体SD均为0.3‰。工作范围实验中，6α-OH和6β-OH在5.0-60 ng/mL浓度范围内SD为0.1‰，而6-oxo在10 ng/mL时偏差不可接受，其工作范围确定为15-60 ng/mL。定量限（LOQ）定义为工作范围内最低浓度且三份重复样本SD低于相应合成不确定度的值，结果为6α-OH和6β-OH均为5.0 ng/mL，6-oxo为15 ng/mL。

3.5 中间精密度、偏倚和合成不确定度（u_c）

通过方差分析（ANOVA）计算中间精密度，6α-OH、6β-OH和6-oxo的值分别为0.2‰、0.3‰和0.3‰。偏倚通过比较标准品直接进样值与经过完整样品制备后的测量值计算，最大值分别为0.6‰、0.5‰和0.3‰，表明方法未引入显著的同位素分馏。根据WADA指南公式计算合成不确定度（u_c），6α-OH为0.6‰，6β-OH为0.5‰，6-oxo为0.4‰，均满足WADA要求的不超过1.0‰。

3.6 方法适用性

对三份含有内源性6α-OH（浓度5.5-6.2 ng/mL）的LBCD阴性样本进行分析，6α-OH与ERC（孕二醇PD、11-酮本胆烷醇酮11K、5α-雄-16-烯-3α-醇16EN）的Δδ¹³C绝对值均不大于4.0‰，符合内源性来源特征，且6β-OH和6-oxo均未检出。对五份来自接受治疗性睾酮替代给药的志愿者样本（6α-OH浓度6.27-7.55 ng/mL）进行分析，结果显示6α-OH的CIR值与T、5α-雄烷二醇（5α-diol）和5β-雄烷二醇（5β-diol）一样显著贫化，与PD的Δδ¹³C值在8.0‰至11.0‰之间，明确指示了外源性来源。这些结果证明该方法能够有效区分内源性和外源性6α-OH。

四、讨论与结论

研究讨论指出，由于缺乏市售6-oxo补充剂，未能进行排泄研究以获取6-oxo给药后的真实阳性样本，因此无法在本阶段展示该方法对于6-oxo本身和6β-OH作为潜在补充标志物的适用性。强调将6-oxo和6β-OH纳入验证并非为了取代6α-OH作为主要靶标，而是为未来研究这些额外标志物在CIR确证中的实用性提供基础。

研究结论翻译如下：一种用于同步CIR确证6-oxo和睾酮滥用的方法已被开发和验证，该方法以6α-OH（6-oxo滥用的主要标志物）以及6β-OH和6-oxo本身为目标。该方法产生了具有干净基线的纯净峰，满足了所有针对6α-OH分析的WADA验证要求，并成功扩展至6β-OH和6-oxo。仪器线性范围为6α-OH 315-4829 mV、6β-OH 291-4794 mV和6-oxo 200-3469 mV。定量限为6α-OH和6β-OH均为5.0 ng/mL，6-oxo为15 ng/mL。三种类固醇的中间精密度范围为0.2‰-0.3‰。偏倚范围为0.3‰-0.6‰，表明不存在显著的同位素分馏。6α-OH、6β-OH和6-oxo的合成不确定度分别估计为0.6‰、0.5‰和0.4‰。对含有内源性和外源性6α-OH的真实样本的应用证实了方法的适用性。肌肉注射十一酸睾酮后收集的样本分析显示，6α-OH的贫化CIR值与最敏感的类固醇谱标志物（T、5α-diol和5β-diol）相当。总体而言，本研究提出的方法为兴奋剂检测实验室提供了一种优化工作流程的高效策略，能够从单份样本等分试样中同步对所有靶标进行CIR确证并判定其来源。