《Food Science & Nutrition》：Integrated Multi-Omics and Single-Cell Analyses Implicate NOX4 as an Icariin-Associated Oxidative Stress Regulatory Node in Gastric Cancer
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淫羊藿苷（Icariin）是从淫羊藿属（Epimedium）植物中提取的一种异戊烯基黄酮糖苷，作为一种代表性膳食多酚，具有抗氧化、抗炎及抗肿瘤特性。胃癌（Gastric Cancer, GC）是一种主要的非传染性慢性疾病，以复杂的分子改变及氧化还原稳态失调为特
淫羊藿苷（Icariin）是从淫羊藿属（Epimedium）植物中提取的一种异戊烯基黄酮糖苷，作为一种代表性膳食多酚，具有抗氧化、抗炎及抗肿瘤特性。胃癌（Gastric Cancer, GC）是一种主要的非传染性慢性疾病，以复杂的分子改变及氧化还原稳态失调为特征，然而淫羊藿苷潜在抗胃癌活性所对应的分子靶点仍不明确。本研究整合网络药理学、批量转录组分析（TCGA-STAD；GSE15497、GSE84437、GSE84433和GSE26253）及单细胞RNA测序（GSE183904；142,053个细胞），以鉴定胃癌中淫羊藿苷相关候选基因。研究人员系统评估了NOX4的表达水平、预后价值及肿瘤微环境特征，构建并验证了一种NOX4阳性内皮细胞（NOX4pos_Endo）相关分子分型策略及LASSO-Cox预后模型，并通过分子对接和分子动力学模拟探索淫羊藿苷与NOX4之间的潜在相互作用，同时使用AGS细胞进行体外验证。网络药理学鉴定出24个淫羊藿苷–胃癌重叠靶点，其中NOX4显示出显著的预后相关性。NOX4在胃癌中表达上调，并在多个队列中与不良预后相关。在单细胞水平上，NOX4主要表达于一个以内皮细胞为特征的亚群中，该亚群具有血管生成、黏附及细胞外基质重塑相关转录特征。一致性聚类识别出两个具有不同临床结局和生物学特征的分子亚型。一个由SPIRE1、PLCH1、KCNS3、SLC27A2和GRP组成的5基因预后模型在独立队列中表现出中等预测性能。分子对接提示淫羊藿苷与NOX4之间可能存在涉及Ser576和Trp377的相互作用，而分子动力学模拟支持该预测结合构象的稳定性。在AGS细胞中，淫羊藿苷处理与NOX4表达降低及细胞内活性氧（ROS）水平下降相关。总体而言，这些发现将NOX4确定为胃癌中淫羊藿苷相关候选调控节点，并提示NOX4/ROS相关信号可能参与细胞对淫羊藿苷的应答。尚需进一步的实验研究以确定NOX4是否为淫羊藿苷的直接分子靶点，并阐明其治疗相关性。
论文解读：NOX4作为淫羊藿苷相关胃癌氧化应激调控节点的多组学与单细胞整合研究
一、研究背景与意义
胃癌（Gastric Cancer, GC）是全球消化系统最常见且致死率最高的恶性肿瘤之一。尽管手术、化疗、靶向治疗及免疫治疗取得了进展，晚期胃癌患者的预后仍不理想。胃癌的进展涉及增殖失控、侵袭转移、血管生成、免疫逃逸及肿瘤微环境重塑等多重相互关联的生物学过程，凸显了该疾病的复杂性与多因素特征，也提示亟需识别有效的治疗靶点和多通路治疗策略。
膳食多酚作为植物性食物中含量最丰富的次生代谢产物，因其抗氧化和抗炎活性而在非传染性慢性疾病（NCCD）包括恶性肿瘤的预防中受到广泛关注。淫羊藿苷（Icariin）是从淫羊藭属（Epimedium）植物中分离的一种异戊烯基黄酮糖苷，已在多种癌症模型中显示出抗炎、抗氧化、免疫调节和抗肿瘤等广泛的药理特性。既往研究表明淫羊藿苷可调控多种肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭和血管生成，在胃癌中也显示出影响恶性生物学行为的潜力。然而，作为一种具有多靶点特性的天然化合物，其在胃癌中的关键靶点和潜在分子机制尚未被系统阐明。
网络药理学为探索天然化合物的“多靶点、多通路”效应提供了系统层面的方法。近年来，多组学数据整合与实验验证的结合进一步提高了网络药理学研究的可靠性和可重复性。因此，本研究将网络药理学、批量转录组分析与单细胞RNA测序相结合，系统探讨淫羊藿苷在胃癌中的潜在作用机制，为开发靶向NOX4/ROS信号的淫羊藿苷功能性食品策略预防胃癌这一NCCD提供理论依据。
二、主要技术方法
研究人员整合了多种生物信息学与实验技术开展研究。数据来源包括TCGA-STAD队列（主要队列）及GEO数据库中的GSE15497、GSE84437、GSE84433（外部转录组验证队列）和GSE26253（免疫治疗复发/非复发队列），单细胞转录组数据来自GSE183904（含40例胃组织样本，其中29例肿瘤样本和11例正常样本）。主要技术方法包括：利用limma包进行差异表达分析；采用WGCNA构建加权基因共表达网络；运用Seurat包处理单细胞RNA测序数据并通过Harmony算法校正批次效应；使用inferCNV推断拷贝数变异以识别恶性细胞；采用CytoTRACE评估细胞分化状态；运用CellChat进行细胞间通讯分析；通过clusterProfiler和GSVA进行功能富集分析；使用SCENIC进行转录因子调控网络分析；利用scMetabolism评估代谢通路活性；采用ConsensusClusterPlus进行一致性聚类；通过LASSO-Cox回归构建预后模型；使用ESTIMATE和MCPcounter算法评估免疫微环境；通过分子对接（AutoDock Vina）和分子动力学模拟（GROMACS）探索淫羊藿苷与NOX4的相互作用；最终在AGS细胞系中进行RT-qPCR、CCK-8、活性氧（ROS）检测和Western blot等体外实验验证。
三、研究结果
3.1 胃癌关键基因筛选及淫羊藿苷交集靶点鉴定
差异表达分析揭示了胃癌与正常组织间显著的转录差异。WGCNA分析鉴定出与胃癌表型关联最强的turquoise模块，其基因主要富集于细胞周期、DNA复制、p53信号通路和病毒致癌相关通路。胃癌相关基因与淫羊藿苷推定靶点取交集获得24个重叠靶点，单因素Cox回归分析显示NOX4与患者预后显著相关，提示其可能是淫羊藿苷在胃癌中发挥作用的潜在靶点。
3.2 NOX4在胃癌中的异常表达、预后价值及功能特征分析
泛癌分析显示NOX4在多种肿瘤类型中异常表达，在胃癌中显著上调。在GSE15497、GSE84437和GSE26253三个独立队列中，高NOX4表达均与不良预后显著相关。GSEA分析显示高NOX4表达组主要富集于ECM-受体相互作用、癌症通路、黏着斑和TGF-β信号通路等肿瘤进展相关通路，而低表达组富集于脂肪酸降解、丙酮酸代谢等代谢相关通路。NOX4表达与病理分级和临床分期显著相关，随疾病进展呈上升趋势。基于NOX4表达和临床特征构建的列线图校准曲线显示预测与观察结果具有良好一致性。
3.3 单细胞转录组分析揭示胃癌细胞异质性和恶性上皮特征
对142,053个细胞进行整合分析后，细胞被注释为11个主要细胞群体，包括T/NK细胞、恶性/上皮细胞、浆细胞、巨噬细胞、内皮细胞、肌成纤维细胞、B细胞、单核细胞、成纤维细胞、肥大细胞和树突状细胞。肿瘤与正常组织间细胞组成存在显著差异，恶性/上皮细胞在肿瘤组织中显著富集。inferCNV分析将上皮细胞分为高CNV和低CNV组，提示存在具有恶性相关CNV特征的上皮亚群。细胞间通讯分析显示巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞等髓系细胞通讯活性较强。CytoTRACE分析显示不同细胞群体具有不同的分化潜能。
3.4 NOX4阳性内皮细胞的功能特征、细胞间通讯及预后相关性
单细胞水平分析显示NOX4主要表达于内皮细胞。将内皮细胞分为NOX4阳性（NOX4pos_Endo）和NOX4阴性（NOX4neg_Endo）两个亚群后，功能富集分析显示NOX4pos_Endo主要与黏附、基质重塑和血管生成相关通路有关，包括黏着斑、整合素信号、ECM-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路和肌动蛋白细胞骨架调控；而NOX4neg_Endo更多与抗原加工呈递等免疫相关通路相关。转录因子分析显示ELK3、JUN和JUNB在NOX4pos_Endo中活性较高。代谢分析显示NOX4pos_Endo与氧化磷酸化、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢和谷胱甘肽代谢更相关。NOX4pos_Endo相关基因签名评分在TCGA-STAD、GSE84437和GSE84433三个队列中均与较差预后相关。细胞间通讯分析显示NOX4pos_Endo与巨噬细胞、成纤维细胞、树突状细胞和T/NK细胞等存在更广泛的相互作用，涉及SPP1、MDK、MIF和ANGPTL2等信号分子。
3.5 基于NOX4阳性内皮细胞特征的胃癌分子分型
基于NOX4pos_Endo相关基因签名进行一致性聚类，将TCGA-STAD队列患者分为两个亚型（Cluster1和Cluster2）。Cluster2的NOX4pos_Endo评分显著更高，总体生存率更低。Cox回归分析显示亚型变量在单因素和多因素模型中均与预后相关。GSVA显示Cluster2富集于上皮-间质转化、血管生成、IL6-JAK-STAT3信号和炎症反应等通路，而Cluster1富集于DNA修复、氧化磷酸化、MYC靶点和脂肪酸代谢等通路。两亚型在巨噬细胞、调节性T细胞和肥大细胞等免疫细胞浸润比例及多种免疫相关分子表达上存在差异。
3.6 NOX4pos_Endo亚型的跨队列验证及共享基因模块鉴定
在GSE84437和GSE84433队列中，k=2均显示相对稳定的聚类模式，Cluster2一致表现出更高的NOX4pos_Endo评分和更差的总体生存率。三个队列中turquoise模块均与Cluster2关联最强，共享基因主要富集于黏着斑、整合素信号、ECM-受体相互作用和肌动蛋白细胞骨架调控等通路。
3.7 NOX4阳性内皮细胞相关预后模型构建及免疫微环境特征分析
通过LASSO回归构建了包含SPIRE1、PLCH1、KCNS3、SLC27A2和GRP五个基因的预后模型。在GSE84433、GSE84437和TCGA-STAD三个队列中，高风险组总体生存率均较差，时间依赖性ROC分析显示模型对1、3、5年总体生存具有中等预测性能。风险评分在单因素和多因素Cox回归中均与预后相关。排除模型基因后重新计算的NOX4pos_Endo签名评分仍与风险评分正相关，支持模型捕获了NOX4阳性内皮细胞相关的更广泛转录特征。高风险组表现出更低的免疫评分、更高的基质评分和肿瘤纯度，多种免疫细胞群和免疫相关分子（如LAG3、CD274、CD276等）在两组间存在差异表达。
3.8 淫羊藿苷与靶蛋白的分子对接及分子动力学模拟
分子对接结果显示淫羊藿苷可容纳于靶蛋白结合口袋内，与Ser576和Trp377等残基形成潜在氢键相互作用。100ns分子动力学模拟的RMSD轨迹显示初始波动后进入相对稳定的平台期，构象叠加显示淫羊藿苷在模拟过程中保持在结合口袋内且位置漂移有限，支持结合模式的稳定性，但该计算证据不能确立淫羊藿苷与NOX4的直接物理结合。
3.9 淫羊藿苷对AGS细胞活力、NOX4表达及细胞内ROS水平的抑制作用
CCK-8实验显示淫羊藿苷以浓度依赖性方式降低AGS细胞活力，IC50值为124.7μM。qPCR分析显示淫羊藿苷处理后NOX4 mRNA表达下降，且随浓度增加更明显。Western blot分析显示NOX4蛋白表达在淫羊藿苷处理后降低，IC50组下降最明显。荧光成像和半定量分析显示细胞内ROS水平在淫羊藿苷处理后也降低。
四、讨论与结论
讨论部分指出，NOX4是NOX家族中一种组成性活性成员，参与细胞内ROS产生和氧化还原敏感信号传导。本研究中NOX4在多个肿瘤类型中广泛上调，在三个独立胃癌队列中与不良生存相关，且与病理分级和临床分期正相关。NOX4来源的ROS可影响PI3K/AKT、HIF-1α、NF-κB、STAT3等与增殖、侵袭、血管生成和治疗耐药相关的通路。单细胞分析将NOX4主要定位于内皮细胞，NOX4pos_Endo细胞具有血管生成、ECM重塑、黏着斑、整合素信号和PI3K-Akt相关程序，以及改变的氧化磷酸化、糖酵解和谷胱甘肽代谢特征。NOX4pos_Endo签名评分在三个独立队列中一致与较差预后相关，支持该内皮状态潜在的临床相关性。基于NOX4pos_Endo签名的分子分型可区分具有不同生物学和临床特征的患者亚型。体外实验中淫羊藿苷降低AGS细胞活力并伴随NOX4表达和细胞内ROS水平下降。分子对接提示淫羊藿苷与NOX4之间可能存在涉及Ser576和Trp377的相互作用。然而，由于观察到的IC50（124.7μM）远高于体内可达到的全身浓度，这些发现应视为细胞培养条件下的初步证据而非临床疗效的直接证明。淫羊藿苷是一种多靶点化合物，NOX4应被视为候选调控节点而非唯一或已确认的介导因子。
研究局限性包括：实验验证仅限于AGS细胞系，缺乏动物实验和独立临床组织验证；ROS水平通过半定量荧光显微镜评估，需流式细胞术等更定量方法进一步验证；分子对接和分子动力学模拟仅提供预测性证据，不能确认直接结合；5基因预后模型反映的是NOX4阳性内皮细胞相关的更广泛转录特征而非直接NOX4依赖性签名。
结论：本研究通过整合生物信息学、单细胞和体外分析，将NOX4确定为胃癌中淫羊藿苷相关候选调控节点。NOX4主要表达于具有血管生成相关转录特征的内皮亚群中，相应基因签名在多个队列中显示预后相关性。在AGS细胞中，淫羊藿苷处理与NOX4表达降低和细胞内ROS水平下降相关。这些发现为NOX4在胃癌中的多维特征提供了表征，并支持进一步研究NOX4/ROS信号在细胞对淫羊藿苷应答中的潜在参与。
