《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Quinoa and Peanut Extracts as Alternatives to Animal-Derived Extracellular Matrix Proteins in Cultured Meat Production
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培养肉是通过培养动物细胞生产的一种可持续且符合伦理的传统畜牧业替代方案。培养肉生产中动物细胞的培养与扩增高度依赖于细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白，这些蛋白是细胞黏附、增殖和分化所必需的。然而，明胶、胶原蛋白、玻璃粘连蛋白（v
培养肉是通过培养动物细胞生产的一种可持续且符合伦理的传统畜牧业替代方案。培养肉生产中动物细胞的培养与扩增高度依赖于细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白，这些蛋白是细胞黏附、增殖和分化所必需的。然而，明胶、胶原蛋白、玻璃粘连蛋白（vitronectin）和Matrigel等常用ECM组分主要来源于动物，引发了伦理关切和可持续性问题。本研究通过计算机模拟分析（in silico analysis）鉴定了含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg–Gly–Asp，RGD）基序的可食用植物来源蛋白，这些蛋白可像ECM蛋白一样促进细胞黏附和增殖。花生（Arachis hypogaea）和藜麦（Chenopodium quinoa）被确定为有潜力的候选植物。研究人员从这些植物种子中制备水溶性提取物，并评估其支持小鼠C2C12细胞和永生化牛卫星细胞（immortalized bovine satellite cells，iBSCs）黏附、增殖和分化的能力。研究发现，提取物主要含有低分子量蛋白，用任一提取物包被的细胞培养表面所支持的细胞附着和增殖水平与动物来源ECM蛋白相当。通过质谱分析确定各植物提取物中最丰富的蛋白，证实了含RGD基序蛋白的存在。随后，研究人员利用无细胞表达系统（cell-free expression system）生产了从每种提取物中鉴定出的一个含RGD蛋白，并评估了含有所生产蛋白的裂解物支持细胞附着和增殖的能力。结果表明细胞附着和增殖增强，提示这些蛋白具有潜在作用。本研究发现表明，花生和藜麦蛋白提取物是培养肉应用中表面功能化的有前景且廉价的无动物源替代方案。
培养肉生产中植物源ECM替代策略的研究解读
一、研究背景与研究意义
全球人口持续增长与肉类需求不断上升，使传统畜牧养殖业面临严峻的环境与伦理挑战。传统畜牧业显著贡献于温室气体排放、土地与水资源消耗、动物福利问题及生物多样性丧失。培养肉作为通过培养动物细胞生产肉类的技术，被视为减少传统肉类生产环境足迹的有前景的替代方案。培养肉生产涉及动物干细胞（包括肌肉和脂肪前体细胞）的分离、扩增和分化，这一过程需要适当的细胞培养基和支持细胞附着的蛋白。理想的体外环境通常依赖明胶、胶原蛋白、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白和Matrigel等ECM蛋白，这些蛋白主要来源于动物。这些蛋白含有细胞结合配体，其中最具代表性的是RGD基序，该基序与细胞表面整合素相互作用，激活调控细胞存活、增殖和分化的胞内信号通路。尽管ECM蛋白有效且已有商业化食品级包被产品，但其主要来源于动物，与开发完全无动物源生产管线的目标不符。因此，植物来源蛋白作为可持续、可规模化且无动物源的表面包被和支架材料替代方案受到关注。已有研究表明，大豆蛋白影响C2C12成肌细胞分化，豌豆蛋白支架促进牛肌肉细胞生长，提示植物蛋白能提供与肌肉细胞-材料相互作用相关的生物活性信号。基于此，研究人员筛选了含有RGD基序的可食用植物蛋白，评估其作为培养肉生产表面包被或支架材料的可行性。
二、研究内容与主要结论
研究人员通过计算机模拟分析，利用BLASTP搜索NCBI非冗余数据库，鉴定出五种含有串联RGD基序（RGDRGD）的可食用植物：花生、藜麦、马铃薯、油菜和小麦。鉴于花生和藜麦种子的广泛可获得性及其含有多个RGDRGD蛋白，研究人员选择这两种植物制备水性蛋白提取物进行后续分析。研究发现，花生和藜麦蛋白提取物包被的表面能支持C2C12成肌细胞和永生化牛卫星细胞的附着和增殖，其效果与明胶（对C2C12细胞）和玻璃粘连蛋白（对iBSCs）相当。藜麦蛋白包被在支持iBSCs附着和生长方面表现尤为突出，达到约70%融合度，与玻璃粘连蛋白对照相当。两种植物蛋白包被还支持了细胞的成肌分化，表现为肌管形成和成肌标志物（MyoD、MyoG、MyoHC）的表达。质谱分析鉴定了提取物中的大量蛋白，其中花生提取物中的双功能抑制剂蛋白（A0A444Y5I1）含有一个RGD基序，藜麦提取物中的Cupin type-1结构域蛋白（A0A803M7P7）含有两个RGD基序和一个LDV基序。研究人员利用烟草BY-2细胞无细胞表达系统生产了这两种含RGD蛋白，并评估了含有重组蛋白的裂解物支持细胞附着和增殖的能力。结果显示细胞附着和增殖有所增强，但与不含重组蛋白的BYL对照相比无统计学显著差异，因此尚不能将细胞效应完全归因于单一含RGD蛋白。
三、关键技术方法
研究人员主要运用了以下关键技术方法：计算机模拟筛选（利用BLASTP搜索NCBI nr数据库鉴定含RGDRGD基序的可食用植物蛋白）；蛋白提取与SDS-PAGE分析（从花生和藜麦种子制备水溶性蛋白提取物并分析其分子量分布）；细胞培养与功能评估（C2C12小鼠成肌细胞和永生化牛卫星细胞系iBSCs的附着、增殖和分化实验，采用CCK-8代谢检测法量化细胞数量）；RGD抑制实验（用RGD肽预处理细胞以验证RGD介导的细胞附着机制）；质谱蛋白质组学分析（LC-MS/MS结合DIA采集模式，使用Spectronaut 19处理数据，iBAQ值作为定量输出，UniProt数据库进行蛋白鉴定和GO功能注释）；无细胞蛋白表达（利用烟草BY-2细胞裂解物BYL系统表达含RGD基序的候选蛋白）；免疫荧光分析和Western blot（检测成肌分化标志物蛋白表达）；RT-PCR和RT-qPCR（检测成肌标志物基因转录水平）。
四、研究结果
计算机模拟分析鉴定候选植物。 通过BLASTP搜索，研究人员从五种可食用植物中鉴定出含RGDRGD基序的蛋白，其中花生含70个、藜麦含20个。SDS-PAGE分析显示花生提取物主要含10–25 kDa蛋白，藜麦提取物主要含10–15 kDa和40–50 kDa蛋白。
植物蛋白提取物包被增强C2C12成肌细胞和iBSCs的细胞附着。 在非细胞结合培养皿上包被花生和藜麦蛋白提取物后，C2C12细胞和iBSCs均表现出显著增强的附着和增殖。花生蛋白包被使C2C12细胞数量增加约50%，藜麦包被使iBSCs达到约70%融合度，与玻璃粘连蛋白对照相当。CCK-8定量分析显示，明胶、花生和藜麦蛋白包被使C2C12细胞数量较未包被对照增加约2.5倍。
植物蛋白提取物包被支持C2C12成肌细胞和iBSCs的分化。 在分化诱导条件下，两种细胞在花生和藜麦蛋白包被表面上均形成细长肌管。RT-PCR检测到MyoG和MyoHC等成肌标志物转录本表达。RT-qPCR分析显示MyoHC表达在各包被条件下较未诱导对照增加约1.2–1.5倍。免疫荧光分析确认了MyoD和MyoG蛋白水平的表达，其中MyoG信号在分化细胞中更为明显。
蛋白质组学分析鉴定花生和藜麦提取物中含RGD的候选蛋白。 质谱分析在花生提取物中检测到313个蛋白命中，藜麦提取物中检测到882个。GO分析显示花生蛋白主要涉及营养储存和蛋白酶抑制功能，藜麦蛋白则呈现更广泛的功能分布。在丰度最高的15种蛋白中，花生双功能抑制剂含1个RGD基序，藜麦Cupin type-1蛋白含2个RGD基序和1个LDV基序。
无细胞表达含RGD蛋白及其功能评估。 利用烟草BYL无细胞系统成功表达了花生双功能抑制剂（约19 kDa）和藜麦Cupin type-1片段（约21 kDa）。含有重组蛋白的裂解物包被表面支持了细胞附着和增殖，但与BYL对照相比无统计学显著差异，提示BYL自身成分可能提供了促进细胞附着和生长的背景效应。
五、讨论与结论
讨论部分指出，花生和藜麦蛋白提取物作为无动物源表面功能化材料具有良好前景，其效果与明胶和玻璃粘连蛋白相当。藜麦蛋白包被在最高测试浓度（7.86 μg/cm2）时出现细胞数量下降，可能与其含有的皂苷等杂质有关。花生提取物中检测到Ara h 2和Ara h 6等主要过敏原蛋白，藜麦虽未检测到明确过敏原但也不能排除其致敏潜力，这对食品级应用构成重要安全考量。含RGD蛋白的无细胞表达产物未能显示出显著优于BYL对照的效果，可能因为重组蛋白未经纯化、浓度和表面可及性不足，或BYL自身成分提供了背景促进效应。研究尚不能建立含RGD蛋白与提取物细胞黏附活性之间的直接因果关系。
研究结论：本研究证明了植物来源蛋白提取物作为食品级包被材料支持培养肉应用中细胞附着、增殖和分化的潜力。花生和藜麦提取物促进了C2C12和iBSC细胞的附着、增殖和分化，表明这些提取物可作为传统动物来源或纯化ECM组分的替代方案。蛋白质组学分析揭示了两种提取物中多样的蛋白组成，并鉴定了含RGD基序的高丰度蛋白。尽管含RGD蛋白的无细胞表达产物支持了细胞附着和增殖，但效果与BYL对照无显著差异，尚不能确立直接因果关系。过敏原蛋白的存在是食品应用转化的重要考量因素。未来研究应聚焦于鉴定负责细胞黏附的具体组分和机制，包括使用纯化含RGD蛋白和适当功能对照的实验，同时评估所得包被材料和最终产品的免疫反应性和食品安全性。总体而言，这些发现为培养肉生产中植物来源、食品兼容包被材料的开发奠定了基础，并凸显了使用蛋白提取物所伴随的机遇与挑战。
