《Environmental DNA》：Environmental DNA at the Population Level: Advancing Conservation Through Non-Invasive Genetic and Genomic Approaches
环境DNA（environmental DNA, eDNA）已成为一种变革性的非侵入性工具，用于生态监测和保护生物学。除其广泛用于物种检测和群落评估外，将基于eDNA的工具应用于评估遗传变异和监测生态系统健康日益受到关注。这对于难以发现或濒危物种尤为重要，因为这些物种的传统种群遗传学方法常因必须避免侵入性采样及样本量小而受到限制。在本系统综述中，研究人员基于83项研究（72篇研究论文和11篇综述）的数据集，综合了基于eDNA的种群遗传学的最新进展。研究人员特别强调核DNA（nuclear DNA, nuDNA）在捕获种内遗传变异方面的潜力。研究人员识别出若干技术限制，如DNA拷贝数低、等位基因缺失（allelic dropout）以及无法分配个体基因型，这些目前阻碍了eDNA在保护基因组学中的直接应用。研究人员提出使用基于等位基因频率的方法，从eDNA数据估计种群遗传参数，例如有效种群大小（effective population size, Ne）。这些方法对于缺乏参考基因组的非模式物种尤其有价值，并且非常适合无法直接采样的情境。研究人员还探讨了eDNA池测序（Pool-seq）技术的应用以提高成本效益，并提出一种估计最低贡献个体数量的潜在策略。整合这些方法有望将eDNA的应用从生物多样性监测扩展到非侵入性种群遗传推断的综合框架。
1 Introduction
引言指出保护生物多样性不仅需要保护物种和生态系统，还必须保护支撑种群健康、进化潜力和长期存活的遗传多样性。有效种群大小（N
e）是反映遗传漂变和近交导致多样性丧失速率的关键指标，已纳入全球保护政策框架。然而传统遗传参数估算依赖于捕获个体获取组织样本，对珍稀、难以发现或受保护物种具有侵入性、资源密集且常不可行。环境DNA（eDNA）作为非侵入性替代工具，可从水体、土壤等基质中收集生物脱落或降解的DNA片段，但将其应用于种群水平的遗传推断仍面临混合DNA、低拷贝数和等位基因缺失等挑战。本系统综述旨在弥合eDNA监测与保护基因组学之间的方法鸿沟，重点关注核DNA（nuDNA）和基于等位基因频率的分析框架。
2 Methods
方法部分描述了遵循PRISMA指南进行的系统综述，未预先注册方案，因研究间方法异质性未进行定量荟萃分析。检索于2025年9月25日在Scopus、Web of Science和PubMed三个数据库进行，查询式结合eDNA术语与种群遗传学术语。初步筛选排除2010年前、非英文和非同行评审文献，随后通过标题/摘要和全文评估排除不相关研究。数据提取由一名评审员进行，并由第二名交叉核对。最终纳入72篇原始研究论文和11篇综述。
3 Results
3.1 Systematic Search Results
系统检索初步获得1072条记录，去重后保留558篇。经年份、语言和同行评审标准排除77篇，经标题与摘要筛选排除354篇，经全文评估排除46篇，并手动补充2篇奠基性研究，最终83篇文献满足纳入标准。评审员间在标题/摘要筛选阶段一致性为98.8%，全文评估阶段为96.4%。
3.2 Overview of eDNA in Population Genetic Studies
3.2.1 Publication Trends and Environmental Focus
基于eDNA的种群遗传研究数量随时间持续上升。在报告实证采样和环境元数据的28项研究中，90%在自然环境开展，其中水生环境占主导（90%），淡水（62%）多于海洋（28%）。淡水研究进一步分为池塘（31%）、湖泊（20%）和河流（27%），河流近年开始受到更多关注。
3.2.2 Targeted Species and Sampling Materials
目标物种集中在水生脊椎动物，鱼类是最主要类群，其中鲤鱼（Cyprinus carpio）研究最多。水是水生研究的主要采样基质，沉积物等替代基质受到关注。陆地研究使用更多样化基质，如沉积物、足迹土壤，也出现了从尸体唾液提取eDNA的间接采样方法。
3.2.3 DNA Marker Preferences
82%的研究仅使用线粒体DNA（mtDNA），最常用细胞色素氧化酶I（COI）和D-loop区域；仅12%的研究仅针对核DNA（nuDNA），且多为近5年出现。核标记中微卫星使用最普遍，而单核苷酸多态性（SNPs）开始被采用。
3.2.4 Genetic Diversity Metrics
约30%的综述研究仍主要使用存在/缺失数据进行物种检测。代谢编码管道常用操作分类单元（OTUs）或扩增子序列变体（ASVs）推断种内遗传变异，但其准确性存在争议。少数研究采用了经典种群遗传指标，如单倍型数量（N
h）、单倍型多样性（H
d）、核苷酸多样性（π）、遗传分化指数（F
ST）。估算N
e的研究仅两项，且均仅使用mtDNA，只能反映雌性有效种群大小（N
ef）。
3.2.5 Sequencing Technologies
Illumina MiSeq平台因兼容短、高度片段化DNA而占主导地位，牛津纳米孔等三代测序平台也受到关注。Sanger测序仍用于少量扩增子或物种的靶向分析。
4 Discussion
4.1 Key Properties and Biological Factors Shaping eDNA Dynamics
eDNA动态受物种生物学和环境因素共同影响。DNA脱落速率随个体大小、年龄、代谢率、生理状态及生活史事件变化，直接影响eDNA可检测性。运输作用尤其在流动水体中可导致远距离检出，需结合空间分层采样和水动力学模型进行校正。降解与持久性受温度、紫外线、pH和微生物活动等调控，吸附到颗粒可增强或降低eDNA稳定性，对种群遗传解释具有重要影响。
4.2 Nuclear vs. Mitochondrial eDNA: Balancing Detection and Genetic Resolution
研究显示大多数eDNA研究优先使用mtDNA，因其拷贝数高、参考数据库完善。但mtDNA为单倍体、非重组和母系遗传，易低估种内多样性，无法捕捉重组、杂交和基因渐渗等过程。相比之下，nuDNA具有双亲遗传和重组特点，可提供更高种群分辨率，但其拷贝数较低，易导致稀有等位基因漏检，且缺乏完整核参考数据库。针对低检测率，可采用过滤采样、靶向多拷贝核基因以及连锁标记系统，将物种特异性标记与附近多态位点结合，以减少混合DNA的歧义。
4.2.1 From Microsatellites to SNPs: The Microhaplotypes
微卫星因依赖片段长度分析，在降解eDNA中适用性差，易产生扩增偏差，且多等位基因特性使等位基因判定复杂，常低估遗传多样性。SNPs作为更稳健的替代标记，其双等位性质简化错误率和分析复杂度，组合多个紧密连锁SNP形成的微单倍型可显著提高分辨率。SNPs还支持低成本、可扩展的池测序（Pool-seq）和靶向测序策略。
4.3 Estimation of Different Genetic Parameters With eDNA Approaches
由于eDNA高度降解且来自多个未知个体，无法重建完整个体基因型，个体水平方法不适用，转而依赖等位基因频率或单倍型频率进行群体推断。
4.3.1 Estimation of the Number of Individuals Contributing to a Sample
eDNA浓度与个体总数之间的直接相关性受环境因素干扰，因此研究重点转向估计贡献样本遗传多样性的最少个体数。简单将检测到的等位基因数除以倍性会低估多样性，概率模型如基于微卫星等位基因频率的似然方法可提供更可靠估计。但微卫星分辨率有限，宽SNP面板和微单倍型在解析复杂遗传混合物中表现更好。
4.3.2 Ne Estimation With eDNA
由于缺少个体基因型，基于连锁不平衡或亲缘关系的方法通常不适用。有前景的替代方案是位点频率谱（SFS）方法，如Stairwayplot2，可利用等位基因频率分布重建种群历史，无需完整参考基因组，且适合片段化数据。也可通过时间序列样本追踪等位基因频率变化估计N
e，或使用基于核苷酸多样性的公式如N
e = π/(2μ)（mtDNA）或N
e = π/(4μ)（nuDNA）。为获得全面推断，建议优先采用nuDNA。
4.3.3 Estimation of Additional Genetic Parameters via eDNA
eDNA无法估计依赖个体基因型的参数，如观测杂合度（H
o）、近交系数（F
IS）和连锁不平衡（LD）。但可估计等位基因频率、期望杂合度（H
e）、核苷酸多样性（π）、单倍型多样性（H
d）、单倍型数量（N
h）、次要等位基因频率（MAF）、分离位点数（S）、等位基因丰富度、私有等位基因和F
ST等。充分测序深度和合理采样设计对减少偏差至关重要，稀疏曲线可帮助评估采样充分性。
4.3.4 Pool Sequencing Approaches for eDNA
Pool-seq将多个个体DNA混合后测序，成本效益高，可估计等位基因频率等群体参数。eDNA天然是混合DNA，看似适合Pool-seq，但经典Pool-seq要求控制贡献个体数和等摩尔输入，这在环境样品中通常无法满足。因此“eDNA Pool-seq”需适应性调整，如使用似然模型估计贡献者数量。当前代谢编码广泛采用Pool-seq思路，但分辨率不足以解析种内遗传变异。
4.4 Current Challenges on the Use of eDNA for Population Genetics Inference
4.4.1 Environmental, Ecological, and Sampling Biases
环境因素如水文事件、季节动态、温度和微生物活动强烈影响eDNA的脱落、运输和降解，导致等位基因频率估计出现时空偏差。eDNA数据缺乏生命阶段、性别和繁殖状态等表型信息，且难以区分DNA来源是否来自活体或死体。DNA片段化会破坏等位基因关联，而高脱落个体或显性单倍型可能过度代表，稀有等位基因易被漏检，造成等位基因丰富度低估。空间和时间重复采样有助于缓解随机效应。
4.4.2 Technical Limitations and Analytical Complexity
PCR偏差（如嵌合体、等位基因缺失）、测序错误和罕见变异检测困难会扭曲遗传多样性估计。去噪算法、数字PCR、靶向测序和杂交捕获可部分改善问题，但缺乏参考基因组或种群特异性等位基因频率数据库时，稀有变异的误判风险仍很高。样本新鲜度、避免污染和酶抑制剂等也对分析质量有显著影响。
4.5 Emerging Genomic Tools Expanding the Power of eDNA in Conservation Biology
4.5.1 eRNA: Real-Time Biological Activity and Physiological Status
环境RNA（eRNA）因寿命短且与代谢活动密切相关，可作为近期生物存在和生理状态的实时指标。eRNA可反映胁迫、疾病或性别比例等功能属性，并有助于区分活体与死体DNA。但eRNA极不稳定，提取和测序技术挑战大，缺乏注释参考转录组，目前更适合水产养殖等受控环境。
4.5.2 Epigenetics: A Window Into Stress and Aging in eDNA
DNA甲基化模式随年龄、压力和环境影响发生变化。分析eDNA甲基化可能估计DNA的“生物学年龄”、揭示环境压力或区分生命阶段。但eDNA的组织来源未知，组织特异性甲基化模式使精确年龄推断复杂化，该方向仍具有探索潜力。
4.5.3 Predator-Derived eDNA: Indirect Monitoring of Elusive Species
捕食者介导采样通过分析捕食者肠道或粪便中的猎物DNA，可间接检测难以发现的物种。但捕食者选择性会引入偏差，消化过程导致DNA差异降解，且猎物序列常被宿主DNA掩盖。阻断引物等策略可改善信号回收，但应用条件复杂，用于种群遗传推断仍需谨慎解释。
4.5.4 Extending eDNA-Based Methods to Historical DNA Samples
eDNA方法可推广到博物馆标本等历史DNA和沉积物DNA（sedaDNA）分析，从而开展长期监测。通过比较数十年的遗传模式，可评估多样性变化、种群结构和进化轨迹，为当代保护提供历史基线。
5 Conclusion
结论强调eDNA方法正在深刻改变保护生物学。尽管eDNA的混合和降解特性限制了个体水平分析，等位基因频率方法和Pool-seq策略提供了目前最现实可行的非侵入性替代方案。本文总结了五点关键建议：利用先验遗传知识设计标记；采用SNP面板或微单倍型等靶向策略；优化采样设计以提高DNA回收率；定制适合eDNA数据的生物信息流程；依赖基于等位基因频率而非基因型的分析框架。这些措施可将eDNA应用从物种检测扩展为非侵入性种群遗传推断的综合工具。
